Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Целью данного проекта является изучение молекулярных механизмов образования потенциальных опухоль-специфических эпитопов в составе экстрамембранных доменов мембранных белков. Такие эпитопы представляют собой уникальные мишени для терапии онкологических заболеваний, в том числе, моноклональными антителами. В качестве объекта исследования нами выбран натрий-зависимый фосфатный транспортер NaPi2b, идентифицированный как мишень для терапевтических антител MX35 (Kiyamova et al., 2008; Yin et al., 2008) и созданных на их основе гуманизированных антител Rebmab200 (Santos et al., 2013), XMT-1536 (Bodyak et al., 2016) и ХМТ-1592 (Fessler et al., 2020), которые в настоящее время проходят клинические испытания для лечения рака яичника, легкого и почки. Особенности распознавания NaPi2b в Вестерн-блот анализе антителами MX35, а также то, что эти антитела специфично накапливаются именно в опухолевых клетках (Rubin et al., 1993; Finstad et al., 1997; Andersson et al., 2009), позволили нам сделать предположение о существовании опухоль-специфического эпитопа в составе транспортера NaPi2b (эпитоп MX35). Этот эпитоп MX35 был идентифицирован в пределах 311-340 а.о. большого внеклеточного домена (ЭМД4) NaPi2b (Kiyamova et al., 2008; Yin et al., 2008). Данные литературы и наши предварительные результаты показывают, что распознавание эпитопа МХ35 антителами зависит от добавления восстанавливающих агентов типа ДТТ в эукариотических клеточных линиях, но не в клетках бактерий. Это, а также тот факт, что NaPi2b является интенсивно гликозилированным мембранным белком с потенциальными сайтами гликозилирования, расположенными в области ЭМД4, позволило сделать предположение о влиянии гликозилирования ЭМД4 на доступность эпитопа MX35 для антител. Кроме того, поскольку злокачественная трансформация клеток связана со значительными изменениями фосфолипидного состава клеточных мембран (Azordegan et al., 2013), мы не исключаем возможности участия также липидов мембран в фолдинге внеклеточного ЭМД4 транспортера, где располагается эпитоп МХ35, по аналогии с белками прокариот (Bogdanov et al., 1996; Bogdanov et al., 2010; Dowhan et al., 2019). Таким образом, мы предполагаем, что распознавание эпитопа MX35 антителами может быть обусловлено конформацией ЭМД4 транспортера NaPi2b, стабилизированной дисульфидными связями, гликозилированием и липидами плазматической мембраны (Minigulova et al., 2019). При этом именно условия опухолевого микроокружения, для которых характерны гипоксия, ацидоз, окислительный и липидный стресс, могут способствовать экспонированию эпитопа МХ35 в клетках опухолей, что делает транспортер NaPi2b привлекательной мишенью для разработки специфичных противоопухолевых препаратов, включая моноклональные антитела. Задачами первого этапа проекта было изучение с помощью методов биоинформатики и молекулярной биологии особенностей строения и топологии NaPi2b, выявление ключевых остатков цистеина и/или аспарагина, которые влияют на образование конформации ЭМД4, ответственной за распознавание эпитопа MX35 моноклональными антителами L2 (20/3), аналогичными по свойствам антителам MX35, и на транспортную активность NaPi2b, а также проверка вклада фосфолипидов в формирование конформации ЭМД4, обеспечивающей доступность эпитопа MX35 для моноклональных антител. Анализ топологии транспортера NaPi2b методами in silico позволил предсказать его топологию и пространственную структуру. Предсказанная структура NaPi2b представляет собой 8 трансмембранных доменов, расположенных в плазматической мембране, внутри которых располагаются QSSS мотивы, обращенные друг к другу и ответственные за связь с ионами натрия и фосфата. Внутрь цитоплазмы обращены С- и N-концевые домены, а снаружи мембраны располагается большой внеклеточный домен ЭМД4, содержащий потенциальный опухоль-специфический эпитоп для антител МХ35 и L2 (20/3), а также терапевтических гуманизированных антител Rebmab200, XMT-1536 и XMT-1592, границы которого определены в пределах 250-360 а.о. С помощью молекулярной динамики in silico мы показали, что наиболее вероятные дисульфидные связи в районе ЭМД4 NaPi2b образуются между остатками цистеина в положениях 350 и 322. Ряд дисульфидных связей, определенный in silico по степени вероятности их образования, представляет собой С350-С322>>>С350-С328>>С350-С303>>С322-С328=ЭМД4 без дисульфидных связей. Интересно отметить, что остаток цистеина в положении 350 может образовывать дисульфидные связи со всеми остальными тремя остатками цистеина в районе ЭМД4. Предположительно связь С350-С322 (наиболее вероятная согласно результатам анализа in silico) является основной в физиологических условиях, а остальные связи, возможно, являются альтернативными и могут возникать при изменении физиологических условий, в том числе условий опухолевого микроокружения. Для выявления ключевых остатков цистеина, дисульфидная связь между которыми обуславливает конформацию ЭМД4, важную для распознавания эпитопа МХ35 и транспорта фосфатов, с помощью сайт-направленного мутагенеза в экспериментальных условиях были созданы генетические конструкты, кодирующие NaPi2b с заменами остатков цистеина на остатки аланина в положениях 303, 322, 328 и 350 (C303A, C322A, C328A, C350A). Созданными рекомбинантными конструктами были трансфицированы клетки рака яичника линии OVCAR-8, в которых отсутствует эндогенная экспрессия NaPi2b, и проверены в Вестерн-блот анализе антителами N-NaPi2b (15/1), распознающими N-концевой домен NaPi2b, и L2 (20/3), распознающими эпитоп MX35. Также была проанализирована транспортная активность мутантных по остаткам цистеина форм транспортера NaPi2b в этих клетках. Показано, что для распознавания эпитопа MX35 важны все четыре остатка цистеина в районе ЭМД4 транспортера NaPi2b, а для его транспортной активности из четырех остатков цистеина критичным является только остаток цистеина в положении 350. При этом наиболее вероятная дисульфидная связь С350-С322 приводит к конформации ЭМД4, обеспечивающий средний уровень транспорта, предположительно характерный для физиологичных условий (рН=7). Вторая по вероятности дисульфидная связь С350-С328 обеспечивает самый высокий уровень транспорта, а самая наименее вероятная связь С350-С303 обеспечивает транспортную активность ниже среднего уровня. В случае, когда мутация затрагивает ключевой остаток цистеина в положении 350, уровень транспортной активности становится очень низким, почти таким же, как на клетках OVCAR-8, которые не экспрессируют NaPi2b. Эти данные согласуются с данными in silico, которые свидетельствуют, что в отсутствии C350, дисульфидные связи образоваться не могут. Эти данные еще раз подтверждают, что конформация ЭМД4 важна для транспортной активности NaPi2b Таким образом, можно заключить, что мы впервые обнаружили роль большого внеклеточного домена транспортера в регуляции его транспортной активности и описали новый потенциальный механизм этой регуляции за счет изменения конформации большого внеклеточного домена транспортера (ЭМД4) из-за ре-аранжировки дисульфидных связей внутри ЭМД4. Пока не совсем понятно, как регулируется эта ре-аранжировка, но мы предполагаем, что большую роль в этом играет микроокружение клеток, включая специфику опухолевого микроокружения, которое сопровождается изменением рН, гипоксией, окислительным и липидным стрессом. Для изучения влияния этих условий на изменение конформации ЭМД4 в результате ре-аранжировки дисульфидных связей, что может влиять на распознавание эпитопа МХ35 и транспортную активность, предполагается использовать предсказанную нами модель пространственной структуры NaPi2b. Для выявления роли гликозилирования в распознавании эпитопа МХ35 были проведены эксперименты in silico и in vitroДля выявления сайтов гликозилирования, потенциально ответственных за распознавание эпитопа МХ35, были экспериментально созданы генетические конструкты, кодирующие мутантные варианты NaPi2b с заменами остатков аспарагина на остатки аланина в положениях 308, 313, 321, 335 и 340: sdm1 (N308А), sdm2 (N313А и N321А), sdm3 (N335А и N340А), sdm4 (N313А, N321А, N335А и N340А) и sdm5 (N335А, N340А, N313А и N321А). Созданными рекомбинантными конструктами были трансфицированы клетки линии OVCAR-8 и проверены в Вестерн-блот анализе антителами N-NaPi2b (15/1) и L2 (20/3). Показано, что замены N335А и N340А не приводят к изменению характера распознавания эпитопа МХ35 как в условиях с ДТТ, так и без него. Это свидетельствует о том, что, возможно, остатки аспарагина в положениях 335 и 340 не гликозилируются, либо это гликозилирование не играет роли в распознавании антителами эпитопа МХ35. А вот замены в положениях N308, N313 и N321 оказались критичными для распознавания эпитопа МХ35 антителами L2 (20/3) по данным Вестерн-блот анализа. Интересно отметить, что согласно результатам анализа in silico система 3NAG с гликозилированными остатками аспарагина в положениях 308, 313 и 321 является более стабильной, по сравнению с системой 2NAG (335 и 340), что подтверждает наши экспериментальные данные. Следующим этапом работы должно быть создание мутантных форм NaPi2b с индивидуальными заменами остатков аспарагина в положениях 295, 313 и 321 на остатки аланина с последующей проверкой их в Вестерн-блот анализе, чтобы определить, какой из них играет роль в экранировании эпитопа MX35. На сегодняшний день с уверенностью можно говорить, что остаток аспарагина в положении 308 является критичным для распознавания эпитопа МХ35 антителами L2 (20/3). В рамках первого этапа проекта нами также были отработаны условия дегликозилирования NaPi2b в составе клеточных лизатов с помощью PNGase F, фермента, который отщепляет высокоманнозные, гибридные и сложные олигосахаридные остатки между N-ацетилглюкозамином и остатком аспарагина. Подобранные условия будут использованы в будущих экспериментах по оценке вклада гликозилирования в распознавание эпитопа MX35 антителами L2 (20/3). С помощью уникальной технологии Eastern-Western-блот анализа получены предварительные данные об участии фосфолипидов, в частности цвиттериона фосфатидилэтаноламина, содержащего первичную аминогруппу и остатки жирных кислот с одинаковой степенью ненасыщенности (DOPE, ФЭ), в распознавании эпитопа MX35 моноклональными антителами L2 (20/3). Таким образом, в рамках первого года выполнения проекта «Опухоль-специфический фолдинг мембранных белков» показано, что остатки цистеина С303, С322, С328, С350, остатки аспарагина N308, N313 и N321, а также, предварительно, ФЭ обеспечивают формирование структуры ЭМД4, определяющей доступность эпитопа MX35 для антител МХ35, L2 (20/3), а также терапевтических гуманизированных антител Rebmab200, XMT-1536 и XMT-1592. Нам впервые удалось показать роль большого внеклеточного домена натрий-зависимого транспортера NaPi2b в регуляции его транспортной активности и описать новый потенциальный механизм этой регуляции за счет изменения конформации большого внеклеточного домена транспортера (ЭМД4) из-за ре-аранжировки дисульфидных связей внутри ЭМД4 транспортера и возможного участия фосфолипидов в этом процессе. С помощью специально разработанного подхода методами in silico проведен анализ топологии и предложена модель пространственной структуры транспортера NaPi2b. Полученные результаты внесли большой вклад в понимание структурных и функциональных особенностей транспортера NaPi2b, важных при дальнейшем изучении NaPi2b в качестве мишени для противоопухолевой терапии в физиологичных условиях и в условиях опухолевого микроокружения клеток.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В результате второго года реализации проекта получены принципиально новые данные о влиянии условий микроокружения опухоли (окислительный стресс, гипоксия, снижение рН) и модификаций (дисульфидные связи, гликозилирование, изменение липидного состава мембран) на топологию натрий-зависимого фосфатного транспортера NaPi2b и фолдинг его большого внеклеточного домена ЭМД4 путем распознавания транспортера NaPi2b моноклональными конформационными антителами методами Вестерн-блот анализа, конфокальной микроскопии и проточной цитометрии, а также подходов in silico. Кроме того, показано, что конформация ЭМД4 транспортера NaPi2b, обусловленная дисульфидными связями, влияет на его транспортную активность. Полученные в этом году с помощью Вестерн-блот анализа цистеиновых мутантов NaPi2b данные подтвердили и дополнили результаты Вестерн-блот анализа 2020 года, согласно которым остатки цистеина в положениях 303, 322, 328 и 350 играют ключевую роль в распознавании потенциального опухоль-специфического эпитопа MX35 моноклональными антителами L2(20/3). Кроме того, дополнительный анализ цистеиновых мутантов транспортера NaPi2b с заменами С303А, С322А, С328А и С350A, эктопически экспрессированных в клетках рака яичника OVCAR-8, с помощью проточной цитометрии, также показал, что в распознавание эпитопа МХ35 вовлечены все четыре остатка цистеина ЭМД4 NaPi2b. Методом управляемой молекулярной динамики в состав ЭМД4 полной предсказанной структуры NaPi2b были введены все возможные дисульфидные связи между остатками цистеина в положениях 303, 322, 328 и 350 и показано, что наиболее вероятной оказалась дисульфидная связь C350-C328, а дисульфидные связи С303-С322 и С303-С328 могут образовываться с меньшей долей вероятности. С помощью метода равновесной молекулярной динамики было проанализировано влияние дисульфидных связей, гликозилирования, липидного состава мембраны и рН на такие параметры эпитопа МХ35 и ЭМД4 NaPi2b как площадь, доступная для растворителя, полная энергия домена и энергия взаимодействия домена с водой. Метод анализа главных компонент смешанных данных и иерархической кластеризации показал, что больше всего на параметры ЭМД4 NaPi2b влияет значение pH, а на параметры эпитопа MX35 - наличие или отсутствие дисульфидной связи С350-С328. Разница во влиянии факторов на параметры ЭМД4 и эпитопа MX35, скорее всего, обусловлена разницей во вторичной структуре, поскольку ЭМД4 структурирован альфа спиралями, а эпитоп MX35 не содержит элементов вторичной структуры. Для изучения влияния гликозилирования на распознавание эпитопа МХ35 транспортера NaPi2 моноклональными антителами L2(20/3) in vitro были созданы генетические конструкции с одиночными заменами остатков аспарагина на остатки аланина в положениях 295, 308, 313 и 321, в дополнение к конструкциям с заменами двух остатков аспарагина сразу в положениях 335 и 340. Все пять аспарагиновых мутантов были проверены в Вестерн-блот анализе и цитометрии, результаты которых показали, что основную роль в распознавании эпитопа МХ35 транспортера NaPi2b моноклональными антителами L2(20/3) играют углеводные остатки, модифицирующие остатки аспарагина в положениях 308, 313 и 321. Полученные данные подтвердили наши исследования in silico о наиболее вероятном гликозилировании именно этих трех остатков аспарагина. Еще одним фактором, влияющим на образование потенциального опухоль-специфического эпитопа МХ35, может быть изменение конформации ЭМД4 в результате его взаимодействия с плазматической мембраной вследствие наличия фосфатидилсерин (ФС) связывающего цвиттерионного мотива DKK, обнаруженного нами в районе 279-281 а.о. ЭМД4 NaPi2b методами in silico и способного случайным образом взаимодействовать с двумя аминофосфолипидами. Не исключено, что такое взаимодействие может приводить к «погружению» части ЭМД4 в мембрану и влиять на степень доступности и распознавания эпитопа МХ35 в опухолевых клетках, поскольку именно в опухолевых клетках происходит одновременное перераспределение отрицательно заряженного ФС и цвиттерионного фосфатидилэтаноламина (ФЭ), на внешнюю сторону плазматической мембраны, что было показано нами при выполнении работ по проекту в отчетном году. Это соответствует результатам Eastern-Western-блот анализа, полученным при реализации проекта в 2020 году, согласно которым ФС, наряду с ФЭ, поддерживал конформацию ЭМД4 транспортера NaPi2b, распознаваемую моноклональными антителами L2(20/3). Полученные данные требуют дополнительного изучения с помощью экспериментальных подходов. В 2021 году получены принципиально новые данные о ре-локализации N-концевого домена фосфатного транспортера NaPi2b на поверхность клеток OVCAR-4 в условиях гипоксии и низкого рН, как мы предполагаем, согласно Правилу Баланса Зарядов, вследствие перераспределения не только отрицательно заряженного ФС, но, самое интересное, и нейтрального по суммарному заряду ФЭ, на внешнюю сторону плазматической мембраны опухолевых клеток яичника. Интересно, что при этом N-концевой домен становится еще одним потенциальным опухоль-специфическим доменом и мишенью для противоопухолевых препаратов. Эти данные требуют дальнейших исследований и будут включены на третий год выполнения проекта сверх заявленного при написании проекта плана. Таким образом, мы предполагаем, что молекулярный механизм образования опухоль-специфического эпитопа МХ35 может заключаться в изменении конформации ЭМД4 NaPi2b вследствие возможной ре-организации дисульфидных связей между остатками цистеина в положениях 303, 322, 328 и 350, изменения паттерна гликозилирования и/или расположения углеводных остатков в результате изомеризации дисульфидных связей в районе ЭМД4, а также в изменении конформации и доступности эпитопа МХ35 вследствие «погружения» в мембрану ФС/ФЭ связывающего мотива DKK в районе ЭМД4 в условиях гипоксии и низкого рН микроокружения опухолевых клеток. Подтверждением нашей гипотезы могут служить уже известные данные об одновременном перераспределении ФС и ФЭ на внешнюю сторону плазматической мембраны в опухолевых клетках, а также наличие в микроокружении опухоли ферментов, включая секретируемый атипичный дисульфидный катализатор QSOX1, глутатиона и тиоредоксина, потенциально участвующих в ре-аранжировке дисульфидных связей внутри экстрамембранных доменов мембранных белков (disulfide shuffling). Отдельным, заслуживающим внимания результатом, который мы получили, является изменение транспортной активности цистеиновых мутантных форм NaPi2b, что, как мы полагаем, может быть обусловлено изменением конформации его большого внеклеточного домена ЭМД4 из-за ре-организации дисульфидных связей, которая может происходить в зависимости от условий окружения (гипоксия и низкий рН). Полученный факт может свидетельствовать о новом типе регуляции фосфатного метаболизма в клетке, что требует дальнейшего более детального изучения. С помощью биоинформатического анализа баз данных открытого доступа TCGA GDC, AACR Genie, ICGC и ArrayExpress получен экспрессионный и мутационный профили гена SLC34A2, кодирующего транспортер NaPi2b, в опухолях различного генеза с учетом клинико-патологических характеристик онкологических больных. Выявлена 521 мутация в гене SLC34A2 в образцах из трех баз данных (TCGA GDC, n= 10967; AACR Genie, n = 85369; ICGC, n= 2197), среди которых 99 функционально значимых мутаций типа миссенс и 12 функционально значимых мутаций типа инсерция-делеция. Используя данные базы ArrayExpress (n=12750), было обнаружено, что в миелоидных опухолях, опухолях кишечника, яичника и матки уровень экспрессии гена SLC34A2 выше, а в опухолях молочной железы, печени, легкого и кожи – ниже, чем в относительно здоровых тканях. Пациенты с высоким уровнем экспрессии в опухолях будут потенциально чувствительны к терапии моноклональными антителами XMT-1536 и XMT-1592, направленными против эпитопа MX35 транспортера NaPi2b. Мы впервые показываем, что не только пациенты с раком яичника, но и с миелоидными опухолями, опухолями кишечника и матки могут быть потенциально чувствительны к терапии моноклональными антителами XMT-1536 и XMT-1592. Кроме того, нами впервые показано, что неоадъювантная химиотерапия может снижать уровень экспрессии NaPi2b в опухолевой ткани пациентов с карциномой яичника, что делает их менее чувствительными к терапии коммерческими моноклональными антителами XMT-1536 и XMT-1592. С помощью анализа выживаемости больных с учетом мутаций и уровня экспрессии гена SLC34A2 было показано, что фосфатный транспортер NaPi2b является прогностическим фактором при злокачественных опухолях мозга, яичника и поджелудочной железы, а также при раке молочной и вилочковой желез. Таким образом, наши новые, интригующие данные о топологии мембранного натрий-зависимого фосфатного транспортера NaPi2b, фолдинге его отдельных доменов, как с применением мутантных форм транспортера, так и в условиях опухолевого микроокружения (гипоксия, низкий рН, изменение липидного состава плазматической мембраны и окислительный стресс) имеют как фундаментальную значимость, так и большое прикладное значение. Нами сформулирована новая гипотеза о возможном типе регуляции транспортной активности NaPi2b путем изменения конформации его большого внеклеточного домена, функция которого пока не известна. Благодаря полученным нами результатам выявлены новые когорты больных, потенциально чувствительные и нечувствительные к терапии коммерческими моноклональными антителами XMT-1536 и XMT-1592, и показана принципиальная возможность разработки новых, более специфичных противоопухолевых препаратов, включая биспецифические антитела, направленных сразу против двух потенциальных опухоль-специфических доменов (ЭМД4 и N-концевой домен) натрий-зависимого фосфатного транспортера NaPi2b.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Данный проект посвящен изучению молекулярных механизмов экспонирования потенциальных «oпухоль-специфических» участков (эпитопов) трансмембранных белков в условиях, имитирующих опухолевое микроокружение, на примере фосфатного транспортера NaPi2b. В 2022 году мы оптимизировали подходы и условия для выделения и очистки NaPi2b и/или его доменных фрагментов и провели дополнительные исследования его структуры. Кроме того, мы получили новые данные об особенностях распознавания моноклональными антителами (мАт) потенциальных опухоль-специфических доменов NaPi2b, включая эпитоп МХ35, в условиях опухолевого микроокружения (ОМ). В 2022 году были получены доказательства опухоль-специфической природы эпитопа MX35 NaPi2b с помощью анализа его распознавания мАт в условиях ОМ, а именно при гипоксии и низких значениях рН. Также, мы показали, что N-концевой домен NaPi2b меняет свою локализацию с внутриклеточной на внеклеточную в условиях ОМ в соответствии с Правилом Баланса Зарядов («Charge Balance Rule», Bogdanov et al. 2008). Была проведена большая работа по клонированию и очистке рекомбинантных фрагментов экстрамембранного домена 4 (ЭМД4 или большого внеклеточного домена, ВКД), а также полноразмерного, эндогенно экспрессируемого транспортера NaPi2b с помощью амфифильных сополимеров, в том числе в составе комплекса с мАт. В соответствии с рекомендациями рецензентов были выполнены дополнительные работы по изучению структуры транспортера NaPi2b с помощью AlphaFold2 и криоэлектронной микроскопии (криоЭМ). Основные доказательства опухоль-специфической природы эпитопа МХ35 NaPi2b были получены путем количественной оценки распознавания эпитопа МХ35 мАт L2(20/3) в условиях ОМ с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии живых интактных клеток рака яичника (РЯ): 1) Показано, что при культивировании клеток РЯ OVCAR-4 в условиях гипоксии (1 % O2) и низкого значения pH (5,8-6,5) эпитоп MX35 распознается мАт L2(20/3) почти в два раза лучше, чем в стандартных условиях культивирования (нормоксия – 21 % О2; pH 7,4). Для этого был разработан алгоритм количественной оценки степени распознавания эпитопа МХ35 транспортера NaPi2b мАт, который проводили с учетом уровня экспрессии NaPi2b в опухолевых клетках мАт против его N-концевого домена; 2) Получены доказательства влияния посттрансляционных модификаций на доступность эпитопа МХ35 с помощью анализа живых интактных клетках РЯ OVCAR-8, транзиентно экспрессирующих мутантные формы NaPi2b. Было показано, что отсутствие каждого из цистеинов в положениях 303, 322, 328 и 350 (имитация восстановления дисульфидных связей), а также аспарагина в положении 313 (имитация дегликозилирования) приводит к уменьшению доступности эпитопа MX35 для мАт. В ходе изучения распознавания транспортера NaPi2b мАт в условиях ОМ был отмечен необычный феномен локализации его N-концевого домена снаружи интактных опухолевых клеток РЯ, тогда как в обычных условиях культивирования его наблюдали внутри клеток (Bulatova et al., 2022). Наличие в N-концевом домене NaPi2b большого количества отрицательно заряженных аминокислотных остатков и полученные нами результаты позволили предположить, что его топология следует Правилу Баланса Зарядов, согласно которому фосфатидилэтаноламин (ФЭ) на внутреннем слое плазматической мембраны (ПМ) протонирует и нейтрализует заряд отрицательно заряженных аминокислотных остатков доменов трансмембранных белков (ТМБ), обеспечивая их внутриклеточную локализацию, что является одним из возможных объяснений механизма правила «Positive inside rule» (von Heijne, 1986, 2006). Мы показали, что в условиях ОМ ФЭ, как и N-концевой домен находится снаружи интактных клеток РЯ. Это позволило нам предположить, что когда ФЭ в условиях ОМ переходит на внешний слой ПМ, он уже не может протонировать отрицательно заряженные аминокислотные остатки N-концевого домена NaPi2b, что вызывает его релокализацию на внешний слой ПМ. Полученные данные являются первым доказательством справедливости Правила Баланса Зарядов для эукариотических ТМБ. Для понимания структуры ЭМД4 транспортера NaPi2b в рамках проекта предполагалось подобрать методы его очистки для структурных исследований. Для начала были синтезированы и охарактеризованы аналоги дорогостоящих зарубежных сополимеров стирола и малеиновой кислоты (SMA), а также липидоподобный термочувствительный сополимер этиленоксида и пропиленоксида (EO/PO) для очистки NaPi2b в составе мембранных нанодисков. Мы подтвердили способность синтезированных полимеров SMA при смешивании с клеточными мембранами формировать наноразмерные дисковидные мембранные структуры, содержащие мембранные белки, окруженные липидами ПМ. Синтезированный сополимер SMA был использован для получения мембранных нанодисков из ПМ клеток РЯ OVCAR-4 с последующей очисткой нанодисков, содержащих NaPi2b, методом иммунопреципитации мАт L2(20/3). Метод требует дальнейшей оптимизации для получения белка в достаточном количестве для проведения структурных исследований. Другой подход для структурных исследований ЭМД4 транспортера NaPi2b заключался в подборке условий для очистки NaPi2b и его рекомбинантных фрагментов из опухолевых и бактериальных клеток разных штаммов. На основе различных экспрессионных векторов были получены генетические конструкции, кодирующие полноразмерный NaPi2b и его «шпилечные» модели, содержащие ЭМД4 NaPi2b (234-362 а.о.), фланкированный его трансмембранными доменами (ТМД) ТМД3 (213-233 а.о.) и ТМД4 (363-383 а.о.) с или без N-концевого домена (1-100 а.о.) и С-–концевого домена (574-690 а.о.). С использованием штамма E.coli, способного к N-гликозилированию белков, был экспрессирован гликозилированный полноразмерный NaPi2b, а также его «шпилечные» модели. Таким образом, показана принципиальная возможность экспрессии гликозилированных форм NaPi2b в бактериальной системе экспрессии. Дальнейшее внимание было сосредоточено на получении рекомбинантных фрагментов NaPi2b, слитых с GST, включая ЭМД4 (234-362 а.о.), 2L (291-361 a.o.), 3L (291-340 a.o.), 4L (311-340 a.o.), а также N-концевой домен (NКД, 1-100 а.о.) из клеток бактерий. Фрагмент GST/2L хорошо экспрессировался, однако основная его часть находилась в нерастворимой фракции бактериальных лизатов. В связи с этим была отработана технология экстракции данного фрагмента из телец включения с использованием мочевины и последующим рефолдингом. Очищенный фрагмент анализировали с помощью ЯМР-спектроскопии, однако его стабильность в растворе оказалась низкой. Таким образом, мы столкнулись с вполне ожидаемыми трудностями очистки мембранного белка NaPi2b для структурных исследований. Тем не менее, нам удалось подобрать условия для очистки рекомбинантного GST/4L (28 кДа) и N-концевого фрагмента транспортера (GST/NКД, 35 кДа) NaPi2b, что позволило с помощью аффинной хроматографии получить высокоочищенные образцы в количествах, достаточных для структурных исследований. Кроме того, нами был предпринят дополнительный подход для очистки полноразмерного NaPi2b, а именно в комплексе с антителами L2(20/3). Нам удалось очистить полноразмерный NaPi2b а также GST-слитый фрагмент ЭМД4 (GST/4L), в комплексе с мАт L2(20/3) и провести пилотный анализ структуры комплексов с помощью криоЭМ с разрешением 7 и 15 Ангстрем, соответственно. В дальнейшем требуется отработка условий пробоподготовки для получения данных препаратов высокого качества, пригодных для разрешения структуры NaPi2b. В соответствии с рекомендациями рецензентов с помощью базы структур белков AlphaFold2 была получена и проанализирована структурная модель полноразмерного человеческого натрий-зависимого фосфатного транспортера NaPi2b. Согласно модели в области ЭМД4 NaPi2b возможно образование двух дисульфидных связей: С303-С350 и С322-С328. Поскольку структуры белков в базе AlphaFold2 построены без учета влияния липидного окружения мембранных белков и их возможного гликозилирования, необходимость разработки подходов для экспериментального разрешения структуры таких сложных трансмембранных гликопротеинов, как NaPi2b остается, по прежнему, актуальной.