Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Первый год выполнения проекта "Роль астроглии в регуляции активности нейронных сетей трансгенных моделей болезни Альцгеймера по данным оптогенетики, эпигенетики, электрофизиологии и поведения" был посвящен, как и было запланировано, постановке и отработке основных методик регистрации электрофизиологических параметров на срезах гиппокампа, определению конкретных режимов оптогенетического воздействия на астроглиальные клетки, отработке методик проведения поведенческих тестов, определению рабочей генетической мышиной модели. Все эти работы проводились с непосредственным консультационным участием приглашенных ведущих ученых во время их визитов в Лабораторию молекулярной нейродегенерации Политехнического университета или в ходе дистанционного общения. Основным результатом этапа этого года является то, что проведены в полном объеме все необходимые подготовительные мероприятия для проведения дальнейших экспериментальных этапов работ, а именно: 1.Создан конструкт AAV5 pZac2.1 GfaABC1D_ChR2(H134R)-mCherry необходимой концентрации 9,1E+14 vg/ml и 2,63E+14 vg/ml, а также проведено исследование подтверждающее его функциональность. 2. Создан конструкт GfaABC1D_opto-a1AR_EYFP необходимой концентрации 2,93E+14 vg/ml, а также проведено исследование на культурах клеток, подтверждающее экспрессию целевого фрагмента в мембране клеток. 3. Отработан протокол стереотаксической инъекции вирусных конструкций в CA1 область гиппокампа мышей. 4. Отработан протокол оптической стимуляции астроцитов в срезах гиппокампа мышей дикого типа (подробно изложен в дополнительных материалах) . Определен оптимальный режим светового воздействия на астроциты - 5 с непрерывного воздействия света с длиной волны 470 нм. 5. Отработаны протоколы проведения поведенческих тестов «Fear Conditioning» и «водный лабиринт Морриса». Проведены предварительные исследования по различиям поведенческих особенностей мышей контрольных групп и экспериментальных животных (трансгенная линия 5xFAD с ранней манифестацией когнитивных нарушений альцгеймеровского типа). 6. Разработаны протоколы анализа роли эпигенетических маркеров (как для исследований, проводимых на срезах мозга, так и на животных in vivo). На данном этапе было запланировано опубликовать обзорные и методические статьи. В соответствии с планом работ подготовлены к публикации и приняты в печать 3 статьи: 1. Обзорная - с постановкой задач по проведению оптогенетических исследований по определению роли астроглии в регуляции активности нейронных сетей (Alla B. Salmina, Yana V. Gorina, Alexander I. Erofeev, Pavel M. Balaban, Ilya B. Bezprozvanny, Olga L. Vlasova. Optogenetic and chemogenetic modulation of astroglial secretory phenotype. Reviews in the Neurosciences (2021 г.). 2. Методическая - по выбору рабочей мышиной модели (Горина Я.В., А. Б. Салмина, Д. П. Чернюк, А. В. Большакова, П. М. Балабан, И. Б. Безпрозванный, О. Л. Власова (Gorina J.V., Salmina A.B., Chernyuk D.P., A.V. Bolshakova, P.M. Balaban, I.B. Bezprozvanny, O.L. Vlasova) Особенности развития и анализа нарушений социального поведения и когнитивных функций у животных с экспериментальной болезнью Альцгеймера. Журнал высшей нервной деятельности (2021). 3. Методическая - по стратегии проведения поведенческих экспериментов (Д. П. Чернюк, А. Г. Зорин, К. З. Деревцова, Е. В. Ефимова, В. А. Приходько, Ю. И. Сысоев, О. Л. Власова, М. В. Болсуновская, И. Б. Безпрозванный). Автоматический анализ данных поведенческого теста "водный лабиринт Морриса". Журнал высшей нервной деятельности (2021 г.). Таким образом, все запланированные на 2020 год работы были выполнены.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В проекте проводилось исследование роли астроглии в регуляции активности нейронных сетей мышей-моделей болезни Альцгеймера (5xFAD) с помощью методов оптогенетики, электрофизиологии, эпигенетики и поведенческих тестов. В результате выполнения второго этапа настоящего проекта по исследованию роли астроглии было показано, что световая активация астроцитов, экспрессирующих ChR2(H134R) приводит к уменьшение значений нормализованного углового коэффициента, т.е. депрессии. Одним из возможных объяснений наблюдаемого эффекта депрессии может быть недостаточная длительность фотоактивации ChR2(H134R)(+)-астроцитов, которая, предположительно должна быть более 10 с. Другим возможным объяснением наблюдаемого эффекта депрессии после фотоактивации ChR2(H134R)(+)-астроцитов является способность астроцитов смещать нейрональную активность как в сторону возбуждения, так и в сторону ингибирования, путем высвобождения нейротрансмиттеров (глутамат) и выброса глио-трансмиттеров (АТФ и аденозина) соответственно. В случае световой активации астроцитов, экспрессирующих Opto-a1AR, наблюдалось достоверное увеличение значений нормализованного углового коэффициента, т.е. потенциация. Возможным объяснением наблюдаемого эффекта потенциации после фотоактивации Opto-a1AR(+)-астроцитов может быть выброс глутамата и D-серина, которые необходимы для формирования долговременных изменений синаптической пластичности. Помимо этого, фотоактивация Opto-a1AR(+)-астроцитов приводит к повышению уровня Ca2+ в астроцитах, что опосредуется специфическими внутриклеточными каскадами вторичного мессенджера. Кроме того, за отчетный период была проведена оценка того, как изменение электрофизиологических характеристик нейронов при оптогенетической стимуляции астроцитов соотносится с характером экспрессии мРНК некоторых немедленных ранних генов (c-Fos, junB, RelA, cRel, Arc) в срезах мозга. В результате было выявлено, что фотоактивация ChR2(H134R)(+)-астроцитов не меняет уровни экспрессии исследуемых генов по отношению к контролю (после индукции ДВП без световой стимуляции). Эти данные позволяют предположить, что активация ионотропных рецепторов астроцитов и вход кальция через мембрану не вызывает длительных изменений экспрессии генов. В случае световой стимуляции астроцитов через метаботропные Gq-связанные Opto-a1AR белки наблюдались изменения уровней экспрессии «ранних» генов. Эти данные предполагают увеличение возможности сохранения текущих молекулярных перестроек в длительно хранящиеся изменения. Также проводили анализ ферментативной активности гистонацетилтрансферазы после фотоактивации Opto-a1AR(+)-астроцитов, который выявил отсутствие достоверных изменений активности гистонацетилтрансферазы. Таким образом, оптогенетическая стимуляция астроцитов, экспрессирующих Opto-a1AR может иметь потенциальный эффект для формирование долговременных изменений синаптических связей у мышей модели болезни Альцгеймера. По результатам экспериментальных исследований опубликована статья: Герасимов Е.И., Ерофеев А.И., Большакова А.В., Балабан П.М., Безпрозванный И.Б., Власова О.Л. (Gerasimov, E., Erofeev, A., Borodinova, A., Bolshakova, A., Balaban, P., Bezprozvanny, I., Vlasova, O.L.) Optogenetic activation of astrocytes—effects on neuronal network function. International Journal of Molecular Sciences (MDPI) (2021 г.)

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В проекте проводилось изучение роли астроглии в регуляции активности нейронных сетей у мышей с моделью болезни Альцгеймера (линия 5xFAD) с помощью методов оптогенетики, электрофизиологии, поведенческих тестов и эпигенетики. В результате выполнения третьего этапа работ в экспериментах ex vivo было показано, что определенный на предыдущих этапах исследования оптимальный режим световой активации астроцитов (t = 100 мс, T = 1 с продолжительность импульсной световой стимуляции 5 минут), экспрессирующих метаботропные (Opto-a1AR) опсины, приводит к достоверному увеличению угла наклона пВПСП после высокочастотной стимуляции (HFS) в переживающих срезах гиппокампа как в экспериментальной группе срезов мышей дикого типа, так и в экспериментальной группе трансгенных мышей с генетической моделью болезни Альцгеймера линии 5xFAD. Было установлено, что оптогенетическая стимуляция астроцитов, экспрессирующих на своей мембране OPTO-a1AR приводит к восстановлению уровня синаптической пластичности у мышей линии 5xFAD. Достоверно значимая разница наблюдалась при сравнении нормализованного угла наклона с 55 по 60 минуту записи между экспериментальными и контрольными группами мышей как дикого типа, так и трансгенных мышей линии 5xFAD. Эти данные коррелируют с полученными раннее в экспериментах по регистрации пВПСП после оптогенетической стимуляции метаботропного конструкта, в которых она приводила к достоверному увеличению значений нормализованного углового коэффициента, т.е. потенциации. Таким образом, в работе показано, что оптогенетическая стимуляция астроцитов при помощи активации Gq-пути через метаботропный опсин Opto-a1AR приводит к усилению синапсов у трансгенных мышей линии 5xFAD и положительно сказывается на формирование долговременной потенциации. В ходе экспериментов in vivo было установлено, что фотостимуляция астроцитов гиппокампа, экспрессирующих OptoGq, приводит к улучшению когнитивных функций трансгенных мышей линии 5xFAD возраста 7 месяцев в тесте на условно-рефлекторное замирание. Продолжительность замирания мышей на этапе «до условного стимула» и «после условного стимула» как в экспериментальной группе трансгенных, так и диких мышей линии 5xFAD значительно различалась на финальный день эксперимента (10 день после обучения). Вместе с тем, в контрольной группе трансгенных мышей в данный промежуток времени не было обнаружено статистически достоверных различий между продолжительностью замирания на указанных этапах, что говорит об отсутствии формирования долговременных изменений, отвечающих за долговременную память. А в контрольной группе мышей дикого типа на 10 день эксперимента наблюдалась стойкая ассоциация удара током со звуком, что говорит о формировании долговременной памяти. По полученным результатам можно сделать вывод, что оптогенетическая стимуляция астроцитов, экспрессирующих метаботропных конструкт Opto-a1AR позволяет корректировать утраченную способность к формированию долговременных изменений памяти у трансгенных мышей с генетической моделью болезни Альцгеймера на уровне in vivo, положительно сказываясь на когнитивных функциях во время поведенческого теста на условно-рефлекторное замирание. Также, проверка влияния оптогенетической стимуляции астроцитов, экспрессирующих Opto-a1AR, на когнитивные функции мышей с генетической моделью болезни Альцгеймера, была осуществлена с помощью поведенческого теста Водный лабиринт Морриса. В этом случае не было получено однозначных результатов. По-видимому, необходимая для проведения эксперимента закрепленная на голове мышей достаточно массивная конструкция, содержащая канюлю, негативно сказалась на способность мышей к плаванию. В результате глобальной засветки ChR2(H134R)-экспрессирующих астроцитов было определено, что она достоверно изменяет параметры пластичности, но не меняет уровни экспрессии исследуемых генов по отношению к контролю в здоровом мозге 2-3-месячных мышей линии C57black и 6-месячных мышей линии B6SJL. Полученные данные позволяют предположить, что в норме активация ионотропных рецепторов в астроцитах и вход кальция через мембрану не вызывают длительных изменений экспрессии генов. В аналогичных экспериментах на срезах гиппокампа 6-месячных трансгенных мышей B6SJL-Tg (5xFAD), моделирующих болезнь Альцгеймера, при парном сравнении групп обнаружилось увеличение экспрессии гена Fos при оптогенетической стимуляции астроцитов во время индукции долговременной пластичности. Полученные данные указывают на необходимость проведения дополнительных исследований и могут косвенно свидетельствовать о том, что оптогенетическая стимуляция астроцитов в мозге мышей с патологией по типу болезни Альцгеймера может вызывать долговременные перестройки, в том числе в работе некоторых генов пластичности. Локальная засветка Opto-a1AR-экспрессирующих астроцитов достоверно изменяла экспрессию генов-кандидатов на срезах мозга 2-3-месячных мышей линии C57black. Однако, в аналогичных экспериментах на срезах гиппокампа 6-месячных здоровых мышей линии B6SJL и трансгенных мышей B6SJL-Tg, моделирующих болезнь Альцгеймера, не было обнаружено достоверных изменений экспрессии исследуемых генов. Суммируя полученные данные, можно сказать, что оптогенетическая активация астроцитов через метаботропные Gq-связанные Opto-a1AR белки эффективно стимулирует транскрипцию «ранних» генов в срезах гиппокампа мозга грызунов в норме. Эти данные предполагают увеличение возможности сохранения текущих молекулярных перестроек в длительно хранящиеся изменения.