Аннотация результатов, полученных в 2021 году
I. Клонированы или приобретены векторы для сверхэкспрессии и супрессии генов SLC30A10 и SLC30A3 в модельных клеточных линиях РТК Для каждого гена подготовлены по две последовательности (заимствованы из баз данных Human CRISPR Knockout Pooled Library и Crispick) гидовых РНК для проведения нокаута генов SLC30A10 и SLC30A3. Данные последовательности были картированы на последовательности мРНК этих генов из базы данных NCBI. Полученные последовательности gRNA клонировали в плазмиду pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458). Плазмидная ДНК выделена из кульутры E.coli (DH5α), трансформированной этой плазмидой. Для обеспечения сверхэкспрессии генов SLC30A10 и SLC30A3 приобретены плазмиды для этих генов; производитель - OriGene Technologies, Inc. (США). II. Проведена трансфекция двух модельных линий РТК векторами для сверхэкспрессии и супрессии генов SLC30A10 и SLC30A3 Для проведения нокаута созданы гомогенные стабильные клеточные линии на основе имеющихся поликлональных линий HuTu-80, SW837. Проведена трансфекция гомогенных линий, клонированных из HuTu-80 и SW837. Каждую из этих двух линий трансфицировали в четырех копиях. Копия rep1 содержала нокаут гена SLC30A3, копия rep2 – нокаут генов SLC30A10 и SLC30A3. Копия rep3 содержала сверхэкспрессию гена SLC30A10 с помощью соотвествующей плазмиды OriGene Technologies, Inc., копия rep4 – сверхэспрессию генов SLC30A10 и SLC30A3 с помощью с помощью соотвествующей плазмиды OriGene Technologies, Inc. Копия rep0 служила интактным контролем. III. Собран единый интерактомный граф молекулярных взаимодействий, включающий гены SLC30A10 и SLC30A3 и не менее пяти нижележащих участников из каталогов путей BioCarta, HumanCYC, Reactome, KEGG, PathwayCentral Собрана база данных OncoboxPD (Oncobox Patgway Database), которая насчитывает 51 672 человеческих молекулярных путей. Интерактомный граф белок-белковых взаимодействий и метаболических реакций в OncoboxPD содержащий 361 654 взаимодействия и 64 095 молекулярных участников, извлеченных из семи баз знаний о путях: Biocarta [1], KEGG [2], HumanCyc [3], Qiagen (https://www.qiagen.com/us/shop/genes-and-pathways/pathway-central ), NCI [4], Reactome [5] и PathBank [6]. Данные собраны путем сочетания ручного и автоматического анализа и обработки этих источников. Пути сохраняются с их исходными названиями в едином формате. Таким образом, информация о генах, генных продуктах и их метаболитах-участниках путей, а также обоих взаимодействиях была извлечена и каталогизирована. На основании нашей БД OncoboxPD подграф генов, генных продуктов и метаболитов – ближайших (не более двух ребер взаимодействий в подграфе) соседей транспортеров цинка и марганца SLC30A10 и SLC30A3 составил 69 вершин, включая начальные вершины, содержащие SLC30A10 и SLC30A3. IV. Проведен микроэлементный анализ не менее 10 образцов модельных клеточных линий РТК с/без измененной регуляции SLC30A10 и SLC30A3 Для 10 образцов клеточных линий РТК HuTu-80 и SW83 (по пять копий для каждой линии, rep0-rep4, см. раздел II) осуществлен микроэлементный анализ биоматериалов. В модельных клеточных линиях рака толстой кишки определено содержание Al, B, Cd, Cu, Fe, I, Mn, Pb, Si, Sr, Zn. Исследование проведено методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой. V. Проведено протеомное профилирование 10 образцов модельных клеточных линий РТК с/без измененной регуляции SLC30A10 и SLC30A3 (ЦКП «Протеом человека») Осуществлен протеомный анализ 10 модельных клеточных линий рака толстой кишки (РТК) HuTu-80 и SW83 с измененной и без измененной регуляции SLC30A10 и SLC30A3 (по пять копий для каждой линии, rep0-rep4, см. раздел II). В предоставленных образцах суммарно было идентифицировано 3404 белка, при этом в среднем для каждой клеточной линии было достоверно определено 3320±19 белков. Для 3152 белков была проведена количественная оценка их содержания в образцах на основе эмпирического показателя LFQ, определяемого в программе МaxQuant. Попарный сравнительный анализ позволил выявить сравнительно небольшое количество различий в белковых профилях исследуемых модельных клеточных линий. VI. Проведено протеомное профилирование 5 парафинизированных образцов тканей РТК пациентов с известным статусом клинического ответа на химиотерапию (ЦКП «Протеом человека» В результате протеомного анализа пяти образцов РТК в виде парафиновых срезов суммарно было достоверно идентифицировано 2093 белка: 1146, 2021, 1911, 1966 и 1589 белков для пяти образцов S1, S2, S3, S4 и S5, соответственно. В качестве незапланированного, но также важного результата протеомного профилирования парафинизированных образцов РТК нужно отметить разработку нового протокола выделения белков из парафиновых срезов. Новый протокол предусматривает стадию депарафинизации в водных условиях, а также использование лизирующего буфера с повышенной концентрацией трис(гидроксиметил)аминометана и дитиотреитола. Данный протокол предполагается использовать в дальнейших исследованиях по проекту. VII. Создана и пополнена коллекция тканей РТК пациентов с известным статусом клинического ответа на химиотерапию до уровня не менее 100 образцов парафинизированной ткани. В дополнение к 75 имеющимся, собрана коллекция 25 образцов парафинизированной ткани от различных пациентов с РТК с известным статусом клинического ответа на химиотерапию. В настоящий момент коллекция насчитывает 100 образцов, из которых 50 образцов взяты от пациентов-мужчин, а 50 — от пациентов-женщин. Минимальный возраст пациентов составил 37 лет, медианный — 60 лет, максимальный — 82 года. 37 образцов получены из опухоли первичной локализации, а 63 — из метастазов в различные органы и ткани: лимфатические узлы (8), печень (30), брюшину (4), легкие (4), двенадцатиперстную кишку (7), яичники (4), мягкие ткани (2), головной мозг (1), рубцовую ткань (3). По стадиям прогрессирования заболевания собранные образцы распределились следующим образом: T1NxM1 — 17, T2N3M0 — 2, T3N0M0 — 2, T3N0M1 — 1, T3N1M0 — 7, T3N1aM0 — 4, T3N1M1 — 13, T3N2M0 — 2, T3N2aM0 — 4, T3N2bM1a — 2, T3N2M1 — 1, T4N0M0 — 7, T4N1M0 — 5, T4N1M1 — 2, T4N1Mx — 1, T4N2M1 — 6, T4aN0M0 — 7, T4aN2aM1b — 6, T4aN2M0 — 2, T4aN2M1a — 2. T4bN0M0 — 1, TxN2M1 — 3. Для трех образцов стадия неизвестна. VIII. Проведено РНК-секвенирование образцов тканей РТК пациентов с известным статусом клинического ответа на химиотерапию – не менее 15 образцов дополнительно к 75 имеющимся, а также не менее 10 образцов модельных клеточных линий РТК с/без измененной регуляции SLC30A10 и SLC30A3 Отсекверировано 15 образцов РТК пациентов с известным статусом клинического ответа на химиотерапию, а также 10 образцов модельных клеточных линий РТК с/без измененной регуляции SLC30A10 и SLC30A3, HuTu-80 и SW83 с/без измененной регуляции SLC30A10 и SLC30A3 (по пять копий для каждой линии, rep0-rep4, см. раздел II). Установлены уровни экспрессии были установлены для 36596 аннотированных генов с соответствующими идентификаторами HGNC. Список использованных источников [1] D. Nishimura, ‘BioCarta’, Biotech Software & Internet Report, vol. 2, no. 3, pp. 117–120, Jun. 2001, doi: 10.1089/152791601750294344. [2] A. Nakaya et al., ‘KEGG OC: A large-scale automatic construction of taxonomy-based ortholog clusters’, Nucleic Acids Research, vol. 41, pp. D353-7, Jan. 2013, doi: 10.1093/nar/gks1239. [3] P. Romero, J. Wagg, M. L. Green, D. Kaiser, M. Krummenacker, and P. D. Karp, ‘Computational prediction of human metabolic pathways from the complete human genome’, Genome Biology, vol. 6, no. 1, p. R2, Dec. 2004, doi: 10.1186/gb-2004-6-1-r2. [4] C. F. Schaefer et al., ‘PID: the Pathway Interaction Database.’, Nucleic acids research, vol. 37, no. Database issue, pp. D674-9, Jan. 2009, doi: 10.1093/nar/gkn653. [5] D. Croft et al., ‘The Reactome pathway knowledgebase’, Nucleic Acids Research, vol. 42, no. D1, pp. D472–D477, Jan. 2014, doi: 10.1093/nar/gkt1102. [6] D. S. Wishart et al., ‘PathBank: A comprehensive pathway database for model organisms’, Nucleic Acids Research, vol. 48, no. D1, pp. D470–D478, Jan. 2020, doi: 10.1093/nar/gkz861.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В отчетный период нами созданы и охарактеризованы клеточные линии с нокаутом белков импортеров цинка, марганца и железа SLC39A8, SLC39A14 и белка экспортера марганца и ко-импортера кальция SLC30A10 в клеточных линиях колоректального рака HCT15 с мутированным KRAS и в линии HuTu80 c не мутированным KRAS. С помощью геномного и протеомного анализов было показано, что в обеих клеточных линиях изменяется уровень белков функционирующих в комплексах связанных с РНК сплайсингом, трансляцией, последующим свертыванием белка и его транспортом, а также сигнального пути VEGFR2. Мы обнаружили что в клеточной линии с KRAS дикого типа изменяется (увеличивается или уменьшается) относительно больше белков чем в клетках с мутированным KRAS, участвующих в работе одних и тех же комплексов, при этом, как изменяется функционирование этих комплексов пока не известно. Дальнейшее исследование трансляции и синтеза белка в клетке позволит лучше понять механизмы влияния транспортеров цинка и марганца на канцерогенез в свете того, что колоректальный рак сильно зависит от скорости синтеза белков. Ингибирование трансляции и рибосомальный стресс является одним из механизмом действия 5-FU и оксалиплатина применяемых для лечения колоректального рака и поэтому в следующем году мы в частности планируем изучить чувствительность полученных клеточных линий к химиотерапевтическим препаратам. Также, был продолжен сбор и характеризация образцов пациентов с известным ответом на химиотерапию и определены для дальнейшего анализа вещества ингибирующие действие нокаутов на клетки и имеющие потенциальное применение для терапии РТК.