Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Был проведен масштабный эксперимент по исследованию и сравнению влияния кетогенной диеты и ограничения калорийности питания на развитие ишемического повреждения головного мозга (инсульта). У животных были собраны образцы кала, для анализа изменения состава микробиоты под воздействием диеты, а также для исследования возможной корреляции микробиотного состава (с помощью секвенирования по 16s рРНК) и тяжести инсульта и/или восстановления после него. У части животных были собраны образцы крови, мозга, почек, печени для анализа изменений, вызываемых данными диетами. На текущий момент данный массив образцов и данных находится в процессе обработки и анализа, завершение которого планируется в следующем году. По предварительным данным эксперимента по влиянию диеты на инсульт у крыс получено, что диеты значимо не влияли на объем повреждения, однако наблюдалась разница в восстановлении неврологического дефицита после повреждения. Влияние ограничения калорийности питания на метаболизм и устойчивость органа к ишемии проверено также в модели ишемии почки у крыс линии OXYS, характеризующихся преждевременным старением. Особый интерес при ОКП и ишемическом почечном повреждении у преждевременно стареющих крыс представляет функционирование митохондрий, которое планируется детектировать по уровням анти- и проапоптотических белков семейства Bcl-2 и митохондриальной деацетилазы SIRT-3. Начат анализ и соотношения белков COX IV и GAPDH, который позволит оценить переключение метаболизма. Нами впервые в мире была осуществлена модель фотоиндуцированного тромбоза почки с помощью красителя бенгальского розового. Мы показали, что фототромбоз почки является релевантной моделью фокального ишемического повреждения. Было выявлено, что при таком повреждении не детектируется значимого нарушения выводящих функций почек, однако образуется ярко выраженный очаг повреждения, а также в моче детектируются маркеры повреждения. Главное отличие данной модели от традиционной в фокальном, а не общем характере ишемии органа. Данная модель была охарактеризована как классическими методами: анализом концентрации креатинина и мочевины в крови, анализом наличия маркера повреждения почек NGAL в крови, гистологическим исследованием ткани, так и с помощью такого нового подхода, как микро-КТ, позволившего получить трехмерное изображение почки и очага повреждения. Начато исследование повреждения и фиброза печени в моделях ишемии/реперфузии печени, подпеченочного холестаза, хронической интоксикации тиоацетамидом и тетрахлорметаном у крыс. Дана характеристика показателей острого печеночного повреждения печени, используя исследование активности маркерных индикаторных ферментов печени в сыворотке крови (сорбитолдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, аспартат- и аланинаминострансферазы). Исследованы показатели фиброгенеза в ткани печени (гистохимическая окраска срезов ткани печени по Массону; определение содержания гидроксипролина спектрофотометрическим методом с реактивом Эрлиха; определение коллагена, альфа-гладкомышечного актина, бета-актина, фибронектина методом вестерн-блоттинга). Для исследования эффекта ацетилирования на пролиферацию был проведен молекулярный докинг перспективных ингибиторов деацетилаз и интересующих нас белков (деацетилаз семейств HDAC и SIRT). По результатам докинга первой молекулой для анализа было выбрано вещество 4-(phenylthio)butanoic acid (PTBA). Получены данные о пролиферации клеток разных типов при разных концентрациях PTBA, возможности влияния данного вещества на прогениторные клетки почки, а также на функционирование митохондрий, параметры окислительного фосфорилирования и гликолиза. Был проведен анализ способов уменьшения ацетилирования белков для активации процесса аутофагии и самообновления клеток, что может благоприятно влиять на метаболизм клеток и тем самым повышать их ишемическую толерантность. Для данных соединений на сегодняшний день напрямую не показано повышение толерантности органов, тем не менее предсказаны их возможные положительные эффекты. Для прицельного снижения концентрации ацетил-КоА и, как результат, активации аутофагии, начаты эксперименты с применением веществ, фармакологически повторяющих эффекты ограничения калорийности питания. Прежде всего начаты опыты с гидроксицитратом на культуре эпителиальных клеток почки MDCK. Большим пластом работ стало исследование трех разных антиоксидантных подходов для защиты клеток мозга от повреждения: с помощью предшественника коэнзима А пантенола, белка пероксиредоксина-6, осуществляющего контроль редокс буфера клеток, и наночастиц селена. Нами был показан их потенциал к защите от ишемии и исследованы механизмы, связанные с биоэнергетикой и функциями митохондрий. Мы показали, что пантенол ингибирует перекисное окисление липидов, улучшает энергетический обмен клеток, нормализует окислительно-восстановительный потенциал системы глутатиона и снижает уровень S-глутатионилированных белков. Еще одним фактором антиоксидантной защиты, который может способствовать повышению толерантности клеток, уже через регуляцию уровня [Ca2+]i, является антиоксидантный фермент Prx-6. Показано, что экзогенный антиоксидантный фермент пероксиредоксин-6 (Prx-6) оказывает комплексное нейропротекторное действие на клетки гиппокампа во время ишемии с тенденцией к более селективной защите астроцитов. Мы выявили, что предварительная инкубация клеток с пероксиредоксином-6 активирует защитные сигнальные пути за счет усиления экспрессии генов, кодирующих цитопротекторные киназы, факторы транскрипции и подавления экспрессии возбуждающих глутаматных рецепторов. Одним из механизмов повреждения ткани при гипоксии и ишемии, а точнее, в момент перехода к реперфузии и реоксигенации, является развитие перекисного окисления липидов мембран вследствие гиперпродукции АФК, поэтому мы исследовали влияние дейтерированной этил-линоленовой кислоты на повреждение и гибель нейральных клеток в моделях ишемии/реоксигенации. Показано, что дейтерированная и недейтерированная линолевая кислоты затрагивают базовый паттерн экспрессии одних и тех же генов-регуляторов редокс-статуса клеток. И после КГД и реоксигенации дейтерированная линолевая кислота способна эффективно подавлять экспрессию генов, кодирующих белки, вовлеченные в продукцию АФК и их токсические эффекты. В итоге, D4-этил-линолеат дозозависимо подавлял индуцированный ишемией некроз клеток коры мозга. Наконец, помимо белков и низкомолекулярных соединений, еще одним классом веществ, потенциально способных повысить устойчивость клеток к ишемии и исследованных нами на моделях ишемического повреждения, стали наночастицы селена (SeNPs). Известно, что наночастицы селена обладают плейотропным действием и способны оказывать нейропротекторные эффекты. Выбор этих наночастиц для исследования был обусловлен тем, что в предварительных экспериментах мы выявили у них эффекты на метаболизм, что является одним из ключевых параметров, анализируемых в данном проекте. Начат анализ влияния состава кишечной микробиоты на ишемическую толерантность мозга при травматическом воздействии. Это исследование было направлено на оценку изменений в составе микробиома кишечника и профиле метаболитов (включая аминокислоты и ацилкарнитины) после острого повреждения мозга и оценку того, может ли исходный микробиом повлиять на последствия неврологической патологии. В рамках заявленного исследования сигнального и метаболического эффекта субстратов и продуктов энергетического обмена на клетки после ишемического повреждения были проведены предварительные исследования, направленные на оценку негативного воздействия повышенного содержания глюкозы на нейрональные стволовые клетки в условиях in vitro. Проанализировано действие глутамина, D-глюкозы и лактата натрия на пролиферацию астроцитов. Помимо пролиферации в отдельной серии экспериментов был исследован энергетический метаболизм астроцитов при различных последовательностях добавления глюкозы и глутамина, а также глюкозы и лактата. В этих экспериментах изучали и сравнивали скорости потребления кислорода (OCR) и уровень закисления внеклеточной среды (ECAR). Для будущих исследований в рамках проекта проведено получение и тестирование флуоресцентных репортерных конструкций для детекции уровня лактата и NADH на основе генетически кодируемых сенсоров, встроенных в вирусный вектор, начато получение стабильных репортерных линий астроцитов с помощью лентивирусной трансдукции и FACS, визуализация и количественный обсчет уровня лактата при гипоксии.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Ключевыми направлениями работ на втором году выполнения проекта стал анализ эффектов различных диет и их миметиков на устойчивость органов (мозг, почки, печень) к повреждению, а также выявление молекулярных механизмов этих эффектов. Мы продолжили исследования действия кетогенной диеты и ограничения калорийности питания на ишемическую толерантность мозга, которые осуществили на нескольких моделях. На модели экспериментального ишемического инсульта мы провели транскриптомный анализ и получили первые данные об изменении экспрессии генов, составе микробиоты и концентрации метаболитов в крови после диеты. Начата работа по оценке изменений транскриптома, метаболома и микробиома после моделирования инсульта на фоне диет по сравнению с животными, питавшимися стандартно. Начат персонализированный анализ всего спектра измеренных параметров для каждого конкретного животного, что позволит выявить тонкие механизмы устойчивости или чувствительности к ишемическому повреждению, в том числе особенности индивидуального ответа на диеты. Мы обнаружили, что в модели окклюзии средней мозговой артерии исследуемые диеты не показали выраженного нейропротекторного эффекта, а кетогенная диета демонстрировала тенденцию к ухудшению устойчивости мозга к повреждению. Интересно, что похожие результаты мы получили на моделях острого повреждения почек при изучении долгосрочных последствий ишемии в виде развития фиброза. В то же время, мы выявили значимые эффекты ограничения калорийности питания на повреждения митохондрий и ассоциированные с этим пути (митофагии и митохондриального биогенеза) в ряде органов у старых животных, что говорит о потенциальном защитном эффекте этого подхода. Нами продемонстрировано, что при старении наибольшее количество повреждений накапливается в стриатуме, гиппокампе и почках, а наименьшее - в легких и печени. Ограничение питания снижало степень повреждения митохондриальной ДНК в ряде органов, а также почти во всех исследованных тканях активировало процессы митофагии и митогенеза, что можно трактовать как усиление контроля качества митохондриальной популяции. В связи с этим были проведены дополнительные эксперименты на старых или преждевременно стареющих животных с целью анализа ишемической толерантности при старении. В этих опытах было выявлено увеличение адаптационного резерва почек за счет ограничения питания, эксперименты на мозге запланированы на следующий год. На данном этапе мы показали изменение когнитивных и неврологических функций, ассоциированное с повреждением митохондрий и падением активности антиоксидантных и регенеративных систем. Мы исследовали механизмы наблюдаемых явлений с акцентом на функцию митохондрий, аутофагию и процессы регенерации. В частности, мы обнаружили уменьшение пула стволовых клеток в почке с возрастом, уменьшение их способности к пролиферации и устойчивости к повреждающим факторам. Наши данные подтверждают ключевую роль микробиоты в развитии повреждений мозга и почек, поэтому мы продолжаем исследование влияния кишечного биоценоза как на саму устойчивость органов к стрессу, так и на отложенные последствия повреждений. Так, мы доказали роль микробиоты в продукции уремических токсинов, которая следует за дисфункцией почек, в том числе после их ишемического повреждения. В эксперименте по влиянию микробиоты на острое повреждение мозга мы обнаружили, что острое повреждение мозга вызвало изменение состава кишечной микробиоты, и влияло на концентрацию в крови нескольких метаболитов, особенно цитруллина и триптофана. Мы продемонстрировали некоторые различия в композиции кишечной микробиоты между группами экспериментальных животных, которые демонстрировали высокие и низкие показатели восстановления неврологических функций. Обнаруженные макроэффекты диет в экспериментах на животных были затем более глубоко исследованы в различных моделях, в том числе клеточных моделях in vitro, с целью анализа конкретных молекулярных механизмов устойчивости и повреждения. В первую очередь, начато изучение потенциальных миметиков диетологических воздействий. Исследование эффектов фармакологического миметика ограничения калорийности питания гидроксицитрата выявило его действие на митохондрии эпителиальных клеток почки, в том числе снижение трансмембранного потенциала митохондрий при низких концентрациях и, наоборот, его повышение при больших концентрациях. Возможность имитации метаболических эффектов диет, в частности, влияние на активность ферментов деацетилаз, была проанализирована биоинформатически по данным транскриптома почек мышей, которые подвергались ишемии/реперфузии почки без и на фоне терапии ингибитором деацетилаз m4-PTB. Показано, что введение m4-PTB на фоне ишемии/реперфузии приводит к снижению экспрессии генов, кодирующих белки энергетического метаболизма (гликолиз и окислительное фосфорилирование). Эксперименты на клеточных культурах почки выявили, что эти ингибиторы способны увеличивать жизнеспособность клеток как при стандартном культивировании, так и в клетках, перенесших ишемическое повреждение. Кроме того, было продемонстрировано, что ингибиторы деацетилаз приводят к снижению гликолитической активности клеток. Большую группу исследований составили эксперименты, касающиеся антиоксидантной защиты почек и мозга. На модели острого повреждения почек выявлено, что антиоксидантная терапия декспантенолом значительно снизила уровень маркеров повреждения в сыворотке крови и моче. Анализ механизмов защитного действия данного антиоксиданта показал, что они были обусловлены повышением уровня общего кофермента А, активности ферментов цикла Кребса и ослаблением глутатионилирования белков, приводившим к нормализации митохондриального метаболизма и стабилизации системы глутатиона. Результаты применения антиоксидантов для повышения толерантности мозга к ишемии показали высокую эффективность подходов на основе наночастиц, в частности селена, таксифолина и их комбинации. Предварительная инкубация клеток коры мозга с наночастицами селена защищала их от повреждения как при ишемии, так и при окислительном стрессе, вызванном перекисью водорода, практически полностью подавляя некротические процессы и существенно ингибируя апоптоз. Механизмы нейропротекции включали ингибирование каспазы-3 во время ишемии, подавление глобального повышения внутриклеточной концентрации Ca2+ и потребления кислорода, активацию экспрессии некоторых антиоксидантных ферментов и снижение активности систем, генерирующих активные формы кислорода во время реперфузии. Интересно, что модификация частиц селена с помощью таксифолина повышала их антиоксидантную и антиапоптотическую эффективность, при этом уменьшая прооксидантные побочные эффекты в случае высоких доз. На клеточных моделях нейральных клеток были также изучены механизмы влияния смены субстрата энергетического метаболизма на ишемическую толерантность. Добавление глутамина приводило к значительному повышению потребления кислорода астроцитами, что говорит о том, что глутамин в астроглии участвует в окислительном фосфорилировании и является одним из ключевых субстратов для получения энергии. Изученные молекулярные механизмы толерантности почки включали также эффекты внеклеточных везикул, продукцию и влияние которых мы исследовали как в интактной культуре клеток эпителия, так и при кислородно-глюкозной депривации. Отдельно проведены работы по оценке воспалительных изменений в почке, а также развитию фибротических изменений. Выявлены противовоспалительное действие производного докозагексаеновой кислоты при ишемическом повреждении почек и изменения ряда метаболических путей при индукции почечного фиброза. При моделировании фиброза в печени показано развитие окислительного стресса, сопровождающееся изменениями в системе глутатиона и углеводно-энергетического обмена, что приводило к увеличению соотношения лактат/пируват, повышению активности ферментов гликолиза и значительному падению скорости сукцинат- и глутамат/малат-зависимого потребления кислорода митохондриями печени.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Мы продолжаем всестороннее исследование влияния метаболического перепрограммирования на ишемическую толерантность тканей и ассоциированные с ней сигнальные пути. Поэтому основная часть работ по Проекту была посвящена изучению влияния диет, в частности, ограничения калорийности питания (ОКП) и кетогенной диеты (КД), а также их миметиков, на метаболизм трех органов (почка, мозг, печень) и их устойчивость к различным острым и хроническим повреждениям. Было проведено секвенирование образцов мозга и почек крыс, находившихся на ОКП или КД, и проанализирован транскриптом, метаболом и микробиом. В частности, коллективом Проекта было оценено действие данных диет на дифференциальную экспрессию генов в мозге, в том числе на фоне ишемического инсульта, и в почке. На фоне диет был изучен метаболический профиль крыс, оценено содержание аминокислот, ацилкарнитинов и оксилипинов в крови, а с помощью секвенирования 16s рРНК был проанализирован состав микробиоты кишечника, а затем проведена работа по интеграции всех полученных данных. Параллельно было изучено влияние КД и гидроксицитрата (ГЦ), который является миметиком ОКП, на инсульт, вызванный фототромбозом, у мышей. При этом и в мозге, и в других органах оценены целостность мтДНК, общее содержание митохондрий и регуляция экспрессии генов, участвующих в поддержании контроля качества митохондрий. КД вызывала ряд изменений в поведении мышей, что мы связываем с влиянием диеты на бактериальный состав микробиома кишечника. КД также защищала мтДНК и повышала экспрессию генов регуляции митохондриального биогенеза (Nfe2l2 и p62), которые были снижены после инсульта. Продолжением экспериментов с КД стали опыты по изучению влияния на ишемическую толерантность мозга ее миметика, бета-гидроксибутирата (βHB) при фототромбозе мозга. βHB уменьшал негативный эффект фототромбоза, повышал силу и выносливость мышей, обеспечивал более выраженное и быстрое восстановление когнитивных функций. Мы обнаружили увеличение экспрессии гена Mtor у мышей, получавших βHB, а также экспрессии Nfe2l2 и ряда генов, связанных с Nrf2, что повторяет данные, ранее полученные при КД. Терапия βHB снижала эспрессию Gfap, а также Il-1b и TNFα, которые значительно возрастали после инсульта, указывая на развитие воспалительных реакций и реактивного астроглиоза. βHB также серьезным образом изменял бактериальный состав микробиома кишечника. Подводя итог, КД, как и ее миметик βHB, может оказывать нейропротекторное действие, обеспечивая улучшение когнитивных и сенсомоторных параметров. Эти эффекты могут быть опосредованы как воздействием на метаболизм, так и сигнальными путями Nrf2/ARE, связанными с подавлением воспаления, повышением антиоксидантной защиты и толерантности митохондрий к повреждениям. Влияние метаболического сдвига на молекулярные механизмы ишемической толерантности были также оценены на первичных нейроглиальных и астроцитарных культурах. Изучено влияние лактата натрия на устойчивость к кислородно-глюкозной депривации (КГД), проанализированы эффекты культивирования в присутствии лактата на Ca-сигнальную систему нейронов и астроцитов коры мозга, на выживаемость клеток, а также на экспрессию генов, кодирующиx про- и антиапоптотические белки и сигнальные киназы. КГД в нейроглиальной культуре вызывала двухфазное увеличение содержания ионов Ca2+ в цитозоле нейронов и астроцитах, а лактат обеспечивал значительное снижение фазы глобального увеличения [Ca2+]i в нейронах, в то время как в астроцитах были подавлены как первая, так и вторая фазы увеличения [Ca2+]i. Глобальное увеличение содержания [Ca2+]i после КГД приводило к увеличению числа апоптотических и некротических клеток, а инкубация с лактатом привела к увеличению выживаемости после КГД. Вторым органом, ишемическая толерантность которого изучается в рамках Проекта, традиционно является почка. Продолжая начатые в прошлом году работы по изучению влияния диет на постишемический фиброз почек, мы проанализировали ряд параметров в ткани почек после ишемии и различных диет. Мы показали, что ОКП сопровождалось самыми высокими изменениям показателей биоэнергетического обмена. Также мы обнаружили изменения в активности ферментов гликолиза и цикла Кребса в почке. В частности, сама ишемия/реперфузия (И/Р) вызывала снижение активности ферментов цикла Кребса, тогда как диеты нивелировали этот эффект. Однако, не было показано выраженного влияния диет на фиброз, кроме некоторого снижения экспрессии коллагена при ОКП. Таким образом, КД и ОКП вызывают метаболические изменения в ткани почки спустя месяц после И/Р, но не снижают развитие фиброза. Анализ механизмов повреждения почки в модели фиброза, вызванного обструкцией мочеточника, показал интересную динамику уровня М1- и М2-макрофагов в ткани почки на разных сроках обструкции. Было показано, что уровень CD68, CXCL1 и CD45 возрастает в почке спустя 3 суток обструкции и продолжает значимо расти к 14 суткам. Аналогичные результаты были получены для провоспалительных генов, ассоциированных с М1-макрофагами (iNOS, CD86) и маркеров М2-макрофагов, связанных с подавлением воспалительного ответа (CD206, CD163). Сделан вывод о том, что обструкция мочеточника, вызывает параллельную активацию как М1-, так и М2-макрофагов, и до срока обструкции 14 дней не наблюдается смены одной популяции другой, и не происходит разрешения воспаления. В связи с важной ролью воспаления, были исследованы противовоспалительные свойства производного омега-3 жирной кислоты, синаптамида, при остром ишемическом почечном повреждении. Было проанализировано воспаление и инфильтрация субпопуляций иммунных клеток в почечную ткань после повреждения и влияние на эти процессы синаптамида. Было показано, что синаптамид значимо снижал уровень интегрина CD11a, приводил к уменьшению количества М1-макрофагов и повышению М2-макрофагов. Анализ экспрессии потенциального рецептора синаптамида GPR110 в ткани почки показал, что его экспрессия значимо возрастает в почках крыс, получавших терапию синаптамидом. Помимо синаптамида, в ходе выполнения Проекта были исследованы и другие противоспалительные соединения, в частности, дексаметазон и нимесулид. Аналогично работам на почке и мозге, проведено моделирование различных типов повреждения печени с анализом развития фиброза, а также оценено влияние на эти процессы диетологических воздействий. Проанализированы последствия метаболического репрограммирования в печени и его действие на устойчивость органа к повреждению. В частности, проведено исследование развития фиброза печени у крыс, вызванного обструкцией общего желчного протока, с последующим содержанием животных на ОКП или интервальном голодании. Холестатическое поражение печени приводило к снижению антиоксидантного потенциала, развитию окислительного стресса, что было ассоциировано с активацией цикла Кребса и глюконеогенеза. Было показано, что ОКП и ИГ не снижали тяжесть повреждения печени (оцененное по активности аспартат и аланиламинотрансферразы и концентрации общего билирубина), не улучшали морфологическую картину и не замедляли развитие фиброза печени, которые провоцировал холестаз. Также исследовано восстановление морфологических и биохимических параметров печени при И/Р и субтотальной гепатэктомии при содержании животных на различных рационах после операции. Подводя итог, можно сказать, что метаболическое репрограммирование, вызываемое диетами, приводит к разным реакциям в исследуемых органах. В некоторых случаях выявляется выраженный защитный эффект, тогда как в других диетическое воздействие не повышает устойчивость органа или даже увеличивает повреждение. Наименьший эффект диеты оказывали, когда применялись не до повреждения, а при уже развившемся фиброзе органа. Для моделей, где воздействие диет показало наилучший эффект, начато тестирование их миметиков, которое позволило увеличить ишемическую толерантность фармакологическим воздействием. Среди ключевых механизмов влияния метаболических воздействий – снижение воспаления, изменение состава микробиоты кишечника, запуск путей защиты митохондрий и поддержания редокс-баланса.