Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В современной вирусологии достигнуты значительные успехи в изучении соотнесения структур и функций вирусных белков, механизма их участия в жизненном цикле вируса и понимании молекулярных основ патогенеза болезней, вызываемых вирусами. Основным направлением способов борьбы с вирусными инфекциями, является применение специфических химиотерапевтических агентов, направленных на подавление репликации вируса в клетке хозяина. Каждый этап жизненного цикла вируса может быть потенциальной мишенью для лекарственной терапии. Перспективные мишени для лекарств против вируса SARS-CoV-2 включают неструктурные белки, например, 3-химотрипсин-подобная протеаза, папаин-подобная протеаза, РНК-зависимая РНК-полимераза или поверхностные белки вируса. Поиск новых противовирусных средств может быть осуществлён с использованием разных подходов. Так, можно проводить тестирование библиотек соединений с использованием инфекционного вируса и потом применять различные методы молекулярной биологии и молекулярного моделирования для выяснения механизма действия соединений, показавших значимую активность. Другой метод предполагает использование так называемых суррогатных моделей, позволяющих проводить поиск ингибиторов ключевых вирусных белков. Первоначально в качестве исходного соединения, была использована (+)-усниновая кислота, которая кислота является вторичным метаболитом лишайников родов Usnea, Cladonia, Alectoria. Для испытаний на противовирусную активность были получены 12 производных (+)-усниновой кислоты, модифицированных по различным положениям дибензофуранового остова: модификацией заместителя в цикле, восстановлением двойных связей и функциональных групп цикла С и дериватизацией функциональных групп цикла С (+)-усниновой кислоты. С целью поиска эффективных ингибиторов вируса SARS-CoV-2, нами было проведено молекулярное моделирование взаимодействия соединений с активным сайтом основной протеазы SARS-CoV-2. Учитывая известную реакционную способность УК, было сделано предположение, что ковалентное связывание SH-группы каталитического аминокислотного остатка Cys145 маловероятно. В связи с этим был выполнен нековалентный докинг в активный сайт основной протеазы. Выполнение оценочной функции докинга показало, что для нескольких новых производных усниновой кислоты минимальная энергия связывания сравнима с таковой для модельного ингибитора ML-188. Учитывая полученные расчетные данные, нами была выполнена экспериментальная оценка ингибирующей активности (+)-усниновой кислоты и её производных в отношении основной протеазы SARS-CoV-2 методом FRET. В результате эксперимента несколько соединений проявили слабую ингибирующую активность в отношении протеазы вируса SARS-CoV-2. Синтезированные в данной работе соединения были проверены с использованием инфекционных вирусов SARS-CoV-2. Тестирование на инфекционном вирусе дает возможность понять облает ли соединение активностью в отношении указанного вируса, но не дает понимания механизма действия данного агента. Проведенные исследования показали, что исходное соединение – (+)-усниновая кислота проявляет выраженную активность в отношении вируса SARS-CoV-2 штаммам Ухань, Дельта и Омикрон. Высокую активность в отношении трех штаммов также показало восстановленное производное усниновой кислоты. С целью выяснения, являются ли производные усниновой кислоты ингибиторами входа вируса, нами дополнительно синтезированные соединения были протестированы в анализе нейтрализации с использованием псевдовирусов, несущих на своей поверхности гликопротеин S вируса SARS-CoV-2. Среди изученных производных обнаружены эффективные ингибиторы входа вируса. На основании данных биологического эксперимента на псевдовирусной системе и тестирования методом ИФА RBD-ACE мы предполагаем, что активные соединения могут связываться в полостях поверхностного белка, кроме RBD. Нами были рассмотрены различные сайты связывания поверхностного белка и на основании анализа результатов молекулярного моделирования мы можем предположить, что производные усниновой кислоты связываются в N-концевом домене в сайте связывания метаболита распада гемоглобина. Функция N-терминального домена поверхностного белка недостаточно хорошо изучена, однако существует четкая взаимосвязь между RBD и NTD. Блокирование NTD может снизить реактивность S-белка SARS-CoV-2 и затруднить контакт RBD с ACE2. Нами был проведен масштабный скрининг разнообразных классов химических соединений в отношении основной протеазы 3CLpro вируса SARS-CoV-2 с использованием разработанной нами биологической тест системы. Было показано, что производные (+)-усниновой кислоты имеют сопоставимый уровень ингибирующей активности по сравнению с их энантиомерами. Производные, модифицированные по кольцу C путем создания гидразоновой, енаминовой связи или конденсированного пиразольного цикла преимущественно проявили слабую активность по отношению к протеазе коронавируса. Наиболее активными соединениями оказались производные усниновой кислоты, содержащие в своем составе тиазольный, селеназольный или тиофеновый цикл, а также тиоэфиры введенные по ацетильной группе фенольного цикла усниновой кислоты. Был проведен виртуальный скрининг антипротеазной активности ряда новых производных тритерпенов. С помощью молекулярного докинга, учитывающего гибкость боковых цепей аминокислот активного сайта основной протеазы вируса SARS-CoV-2, оценивалась энергия взаимодействия новых производных с активным сайтом основной протеазы. Таким образом, нами начато систематическое изучение производных природных соединений в качестве ингибиторов вируса SARS-CoV-2, как имеющих своей мишенью вирусную протеазу, так и действующих по другим механизмам.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В современной вирусологии достигнуты значительные успехи в изучении соотнесения структур и функций вирусных белков, механизма их участия в жизненном цикле вируса и понимании молекулярных основ патогенеза болезней, вызываемых вирусами. Основным направлением способов борьбы с вирусными инфекциями, является применение специфических химиотерапевтических агентов, направленных на подавление репликации вируса в клетке хозяина. Одной из наиболее перспективных мишеней действия вируса SARS-CoV-2 является 3-химотрипсин-подобная протеаза или 3CLpro. Нами разработан высокоэффективный метод скрининга для поиска новых эффективных ингибиторов вирусной протеазы 3CLpro. В основе метода лежит измерение уровня флуоресценции, возрастающего вследствие протеолитической деструкции пептидного субстрата, включающего 3CL чувствительную область полипротеина SARS-CoV-2. С использованием разработанной нами биологической тест системы был проведен анализ ингибирующей активности в отношении основной протеазы 3CLpro вируса SARS-CoV-2 разнообразных классов химических соединений. В качестве тестируемых веществ были исследованы соединения разных химических классов: производные монотерпенового ряда, в первую очередь би- и полициклические или содержащие спироциклический фрагмент; каркасные производные сесквитерпеновых соединений; мочевины, тиомочевины и гетероциклические производные дегидроабиетиламина – доступного дитерпеного соединения; производные тритерпеновых кислот с заместителями в различных положениях природного остова и секо-тритерпеновые агенты и разнообразные производные усниновой кислоты. Выбор соединений для тестирования был сделан на основе анализа современной литературы в области поиска новых ингибиторов 3Clpro. Всего было проверено более 100 веществ. Проведенные нами исследования показали, что наиболее перспективным классом производных природных соединений являются синтетические производные усниновой кислоты – вторичного метаболита лишайника. Нами в рамках работы над задачами проекта в отчетном периоде и основываясь на результатах первого года работы, был проведен синтез как новых производных усниновой кислоты, так и синтезирована значительная серия соединений по описанным ранее методикам. Основываясь на результатах предварительного скрининга библиотеки производных усниновой кислоты, мы синтезировали производные усниновой кислоты содержащие гидразонотиазольный фрагмент. На основе (+)- и (-)- усниновой кислоты были наработаны соотвествующие бромусниновые кислоты. Также были наработаны тиосемикарбазоны различных гетероароматических или ароматических альдегидов путем их реакции с тиосемикарбазидом в этаноле. Затем по реакции (+)- и (-)- бромусниновых кислот с тиосемикарбазонами альдегидов в метаноле были получены целевые тиазолы с выходами 60-92%. Всего было синтезировано 36 соединений. На основании проведенных исследований были сделаны выводы о связи структур с проявляемой активностью. Кроме того, мы измерили кинетические параметры для производных, проявляющих существенную активность в отношении основной протеазы. Для определения кинетических параметров основной протеазы коронавируса измеряли уровень флуоресценции при различных концентрациях субстрата в режиме кинетического сканирования. Скорость ферментативной реакции определяли по кинетическим кривым флуоресценции, рассчитывая изменение флуоресценции в единицу времени при различных концентрациях субстрата. Присутствие любого из проанализированных соединений приводит к значительным изменениям кинетических параметров, что свидетельствует о снижении эффективности работы фермента и доказывает, что вещества действительно являются ингибиторами фермента. Таким образом, мы исследовали 36 производных (+)- и (-)-усниновой кислоты в качестве потенциальных ингибиторов коронавирусной основной протеазы. Девять из исследованных агентов проявили активность в диапазоне концентраций от 13 до 27 мкМ. Среди них четыре соединения были отобраны для более глубокого изучения. В процессе молекулярного моделирования взаимодействия соединений-лидеров с активным сайтом связывания основной протеазы было выявлено, что вещество (+)-7a имеет наибольшее количество контактов с аминокислотными остатками. Для тех же соединений была исследована активность в отношении шести штаммов SARS-CoV-2, включая исходный штамм Wuhan, штамм Delta и четыре линии Omicron (B.1.1.529, ВА 5.2, XBB 1.5 и Kraken). Соединение (+)-7а проявляло активность в дозах от 8,5 до 28 мкМ, с индексами селективности от 67 до 20. Соединения (+)-10g и (-)-10j проявляют умеренную активность, а соединение (+)-10i высокоактивно против штаммов линии Omicron BA 5.2 и XBB 1.5. Поскольку ранее было показано, что производные усниковой кислоты могут быть эффективными ингибиторами входа вируса, мы дополнительно протестировали эти соединения на псевдовирусной системе и обнаружили, что они ингибируют псевдовирус в дозах от 0,6 до 9,5 мкМ, не проявляя заметной активности в тесте ELISA (RBD-ACE2). Таким образом, на основании анализа результатов биологических испытаний и молекулярного моделирования можно предположить, что производные усниновой кислоты связываются в N-концевом домене в сайте связывания метаболита деградации гемоглобина. Блокирование NTD может снизить реактивность S-белка SARS-CoV-2 и препятствовать контакту RBD с ACE2. Для расчета фармакокинетических параметров новых производных усниновой кислоты применялась программа Schrodinger QikProp. Все новые производные в целом удовлетворяют фармакокинетическим критериям, которые свойственны большинству известных лекарственных препаратов. Результатом проведенных исследований является то, что мы нашли эффективные ингибиторы широкого спектра вирусов, проявляющие мультитагетное действие - а именно, вещества являются как ингибиторами основной вирусной протеазы, так и выступают в качестве ингибиторов входа вируса. Перспективным направлением при создании новых биоактивных систем является применение принципа «гибридных» структур. С целью поиска новых ингибиторов мы провели синтез новых соединений – конъюгатов гидразонов камфоры и фенхона и изатина. Было проведено молекулярное моделирование и синтезированные в данной работе соединения были проверены на способность ингибировать основную вирусную протеазу 3Clpro с использованием разработанной нами ранее суррогатной модели. С целью расширения возможной библиотеки производных монотерпеноидов с потенциальными противовирусными свойствами с помощью алгоритма Schrodinger Ligand-based Core Hopping путем подмены природных скаффолдов, была получен ряд виртуальных соединений, содержащих фармакофорные группы, характерные для нековалентных ингибиторов основной протеазы вируса SARS-CoV-2 и разработаны возможные схемы синтеза.