Благодаря этому авторы смогли за короткое время получить данные для целого ряда новых противогрибковых соединений. Анализ этих данных помогает лучше понять механизмы действия соединений и выявить клеточные пути, которые могут служить мишенями для новых препаратов. Разработка упростит и удешевит поиск и тестирование лекарств от грибковых инфекций. Результаты исследования, поддержанного тремя грантами (1, 2, 3) Российского научного фонда (РНФ), опубликованы в журнале Communications Biology.
Ежегодно от грибковых инфекций, в числе которых пневмонии и легочный аспергиллез, умирает более 1,5 млн человек во всем мире. При этом наибольшую опасность представляют штаммы болезнетворных грибов, устойчивые к существующим лекарствам. Количество же известных противогрибковых средств очень ограничено. Существует всего несколько классов таких препаратов, и к ряду из них грибки — например, некоторые виды кандиды, поражающие слизистые,— обрели устойчивость, а потому значительно хуже поддаются лечению. Для решения этой проблемы ученые ищут уязвимости в грибковых клетках, на которые можно нацелить новые препараты. Однако классические методы выявления таких мишеней (протеомный анализ, скрининг мутантных библиотек) требуют много времени и дорогостоящего оборудования.
Исследователи из федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН (Москва) с коллегами предложили простой и быстрый метод для выявления уязвимостей в грибковых клетках.
Схема проведения эксперимента. Источник: Виктория Бидюк / ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН
Авторы использовали в эксперименте пекарские дрожжи — удобный модельный организм, клетки которого быстро делятся и неприхотливы в выращивании. Сначала исследователи с помощью баз данных о белках определили 64 белка, которые выполняют в клетках дрожжей самые важные функции: отвечают за синтез аминокислот (строительных блоков для всех белков), защиту от окислительного стресса, выкачивание токсичных веществ из клетки, энергетический обмен и клеточное деление.
Из целой коллекции дрожжевых штаммов авторы отобрали 64 варианта дрожжей, в каждом из которых один из выбранных белков был помечен флуоресцентным «маячком» — пришитым к нему зеленым флуоресцентным белком GFP. При облучении синим лазером этот белок светится в зеленом спектре.
Далее авторы подействовали на клетки двенадцатью разными препаратами, среди которых были известные противогрибковые лекарства и новые, малоизученные вещества. С помощью прибора, анализирующего свечение клеток, исследователи оценивали, как изменялась интенсивность свечения флуоресцентных «маячков» в зависимости от используемого препарата. Свечение менялось, поскольку клетка в ответ на токсическое вещество (противогрибковый препарат) меняет уровень продукции некоторых белков, и эти изменения отражают характер воздействия лекарства.
Изменения интенсивности свечения GFP-меченого белка. Интенсивность красного цвета пропорциональна повышению уровня свечения, синего — снижению; белый цвет соответствует отсутствию изменений (ноль). Источник: Виктория Бидюк / ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН
Такой подход позволил избежать трудоемкого протеомного анализа, который требует много времени и дорогого оборудования. За короткое время ученые проанализировали клеточный ответ к 12 разным веществам и углубили понимание механизма их действия. Например, эксперимент дал возможность описать ранее неизвестный механизм действия алкилцитидинов — нового класса соединений с противогрибковой активностью, эффективность которых показана в том числе и против грибков, которые поражают объекты искусства и картины.
Оказалось, что в результате воздействия алкилцитинидов активируется биосинтез ароматических аминокислот, и это тесно связано с системами антиоксидантной защиты клетки. Это открывает возможность разрабатывать препараты, которые будут избирательно воздействовать на этот процесс и эффективно бороться с клетками болезнетворных грибков. Особо интересно то, что этот путь присутствует у грибов, растений и бактерий, но отсутствует у человека и животных. Таким образом, препараты, нацеленные на него, будут избирательно действовать на грибы и не затрагивать клетки человека.
В исследовании принимали участие сотрудники Российского университета дружбы народов (Москва), Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе (Москва) и Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН (Москва).«Наш подход позволяет оценивать клеточный ответ на противогрибковое соединение без трудоемкого протеомного анализа: достаточно измерить свечение клеток панели из 64 штаммов. Это быстрее и дешевле, чем полная протеомика, и, что важнее, дает информацию о клеточных процессах, вовлеченных в ответ на лекарство. Мы можем быстро выявлять соединения с новыми механизмами действия, а не просто получать данные “вещество убивает грибную клетку или нет”. Метод отлично работает на модельных дрожжах, и в будущем мы надеемся расширить набор белков для более детальной характеристики механизмов действия отдельных соединений»,— рассказывает участник проектов, поддержанных грантами РНФ, Михаил Агафонов, доктор биологических наук, руководитель группы геномного редактирования промышленных микроорганизмов ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН.
