Ученые Нейрокампуса разрабатывают биосенсоры на основе флуоресцентных белков, переизлучающих свет. Такие молекулярные инструменты помогают регистрировать биохимические события внутри клеток, их органелл, тканей и даже органов.
Ключевое свойство белковых биосенсоров, помимо способности к флуоресценции, –– взаимодействие с определенным внутриклеточным параметром (связывание иона или метаболита, окисление, фосфорилирование). Новые биосенсоры создают «сшиванием» флуоресцентного и сенсорного белков. Последний из них определяет функционирование полученного инструмента.
Механизм работы биосенсоров основан на конформационных подвижках в структуре белковой молекулы. Например, сенсорная часть «узнает» в клетке соединение, связывает его и изменяется в структуре. Так как сенсорная часть «сшита» с флуоресцентным доменом в единый белок, то конформационные изменения передаются и на флуоресцентную часть. В результате меняются спектральные характеристики конструкции. Иными словами, биосенсор по-разному светится в лиганд-связанном и свободном состояниях, окисленном или восстановленном и т. д. (рис. 1).
Инструменты, разрабатываемые учеными Нейрокампуса, — белки, значит, они кодируются геном. Его направляют в изучаемую клетку или орган живого организма. Благодаря этому в режиме реального времени ведется наблюдение за динамикой флуоресцентного сигнала в исследуемой системе.
Биосенсоры представляют мощный инструментарий для современной науки. Однако они сложны в разработке, поскольку необходимо подобрать и совместить сенсорные и флуоресцентные домены без утраты их свойств. В этом заключается главная трудность.
Биосенсоры позволяют регистрировать различные соединения, в том числе с высокой реакционной способностью, например, хлорноватистую кислоту, активные формы кислорода, серы, азота, образующиеся в наших клетках. Эти соединения трудноуловимы для исследователей, поскольку существуют короткое время и быстро реагируют с различными внутриклеточными мишенями. Их эффект может быть как положительным,выраженным в регуляции внутриклеточных сигнальных каскадов, так и отрицательным — в случае бесконтрольного увеличения их концентраций из-за каких-либо нарушений. Разрабатываемые учеными Нейрокампуса инструменты позволяют исследовать роль некоторых таких соединений и в норме, и при патологических процессах.
Также в лаборатории разрабатываются другие биосенсоры для регистрации соединений, которые не обладают высокой реакционной способностью, но играют ключевую роль в метаболизме клеток, например, жирных кислот.
Ученые создали обширную коллекцию генетически кодируемых биосенсоров на различные классы соединений, играющих важную роль в клетках.
Один из недавно опубликованных инструментов Hypocrates позволяет регистрировать в живых системах активные формы галогенов. Это прежде всего биологически значимые хлорноватистая и бромноватистая кислоты. Биосенсор также реагирует с гипотиоциановой кислотой. Эти соединения играют важнейшую роль при воспалительных реакциях. Их также можно классифицировать как сигнальные регуляторы, поскольку появляется все больше сведений в пользу того, что соединения данного класса и их производные специфично модифицируют некоторые белки, обратимо изменяя их функции.
Помимо разработок биосенсоров, ученые Нейрокампуса успешно применяют данную технологию в исследованиях различных биологических процессов, в том числе in vivo в тканях живых организмов (рыб Danio rerio, крыс, мышей).
Недавно специалисты выпустили работу при сотрудничестве с физиками лаборатории Алексея Желтикова из МГУ, посвященную изучению динамики некоторых биохимических параметров в тканях мозга крыс при развитии ишемического инсульта. Для этого гены биосенсоров доставляли в ткань мозга лабораторных животных с помощью вирусных частиц. Через месяц у грызунов в зараженной области мозга флуоресцировали нейроны, так как в них нарабатывался биосенсор. Сразу после инъекции вируса в мозг имплантировали очень тонкие оптические волокна, к которым в дальнейшем подключали систему, позволяющую регистрировать флуоресцентный сигнал в клетках. Ученые моделировали ишемический инсульт у животных путем окклюзии средней мозговой артерии. Это позволило наблюдать за изменениями биохимических параметров в клетках мозга с первых секунд развития патологии. Например, ученые выявили динамику ацидоза в разных структурах мозга при ишемии и выяснили, что пероксид водорода (один из важных маркеров окислительного повреждения) незначительно образуется в клетках в острой фазе ишемического повреждения, однако биосенсор демонстрирует максимальное окисление в клетках на следующие сутки.
Исследования такого рода открывают новые перспективы в понимании механизмов патогенеза инсульта головного мозга. Комбинирование биосенсоров позволяет ученым выявить особенности биохимических изменений, их длительность и динамику в разных клетках.
Применение биосенсоров в медико-биологических исследованиях позволяет получить знания, которые в дальнейшем пригодятся в разработке терапии того или иного заболевания.
Внедрять такие инструменты в ткань человека нельзя, однако их можно использовать в культивируемых человеческих клетках. Например, у пациента с определенным заболеванием можно взять стволовые клетки, дифференцировать их в культуре в интересующий тип клеток и на этой модели с помощью биосенсоров посмотреть, что с ними не так.
Также культивируемые человеческие онкоклетки с экспрессией гена выбранного исследователем биосенсора можно подсадить лабораторному животному и вырастить флуоресцирующую опухоль в условиях in vivo. Далее животным можно вводить различные вещества и исследовать оказываемый ими эффект. Например, установить, как тестируемые соединения влияют на биохимические параметры клеток по изменению флуоресцентного сигнала биосенсора, как это коррелирует в том числе с подавлением опухоли.
Биосенсоры — эффективный инструмент для скрининга лекарственных препаратов. Область исследований будет развиваться еще стремительнее, в том числе в направлении персонализированной медицины.
Ученые разрабатывают новые генетически кодируемые инструменты и улучшают существующие подходы их применения в более сложных системах. Сейчас наблюдается тенденция к исследованиям in vivo. В таких моделях результат информативнее, так как динамика биохимических параметров внутри клетки определена в естественной ее среде и окружении других клеток.
Команда Нейрокампуса планирует развивать подход in vivo для регистрации внутриклеточных событий с помощью биосенсоров, чтобы исследовать разные параметры как при физиологических условиях, так и при патологических состояниях.
