Разработка технологии клонального микроразмножения редких и исчезающих растений криолитозоны в культуре in vitro

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-14-20031

НазваниеРазработка технологии клонального микроразмножения редких и исчезающих растений криолитозоны в культуре in vitro

Руководитель Охлопкова Жанна Михайловна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Восточный федеральный университет имени М.К. Аммосова" , Республика Саха (Якутия)

Конкурс №66 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (региональный конкурс)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-206 - Физиология и биохимия растений

Ключевые слова криолитозона, редкие и исчезающие растения, микроклональное размножение, in vitro , БАВ, оксид графена

Код ГРНТИ34.00.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Сокращение биоразнообразия видов по всем регионам, странам и континентам стало основой одного из ключевых вопросов протокола современного мира. Чрезмерная антропогенная нагрузка, промышленные технологии зачастую с несоблюдением экологических норм и требований, а также обширные лесные пожары наносят урон на природные растительные ресурсы сокращая естественный ареал и численность редких, исчезающих, эндогенных, лекарственных и еще до конца не изученных, в меру своей малой численности, растений. Особую нагрузку в этом плане испытывают северные и арктические территории. Республика Саха (Якутия) занимает северо-восточную территорию (3,1 млн. кв. км.) Российской Федерации, свыше 40% территории которой находится севернее Полярного круга, относящегося к Арктической зоне. Растения Якутии, произрастающие в условиях резко-континентального климата, вечной мерзлоты, короткого вегетационного периода, высокой амплитуды температур, характеризуются не только высоким стресс-адаптационным потенциалом, но и высоким содержанием биологически активных веществ, включая и вторичные метаболиты. В связи с вышеизложенным актуальным представляется создание микроклонов отобранных исчезающих и редких растений (Якутии) путем оптимизации условий культивирования in vitro на базе профильной учебно-научной лаборатории с применением современных тенденций и приемов клеточной биотехнологии инициации роста, размножения, укоренения in vitro и адаптации полученных растений-регенерантов, сравнительный анализ фитохимического профиля в сохраненных интактных растениях и получаемых растениях-регенерантах с применением таргетной масс-спектрометрии, использующей для анализа возможные минимальные навески материала, оценка и подтверждение генетической стабильности регенерантов с целью сохранения видов – объектов исследования, в целом – для сохранения генофонда растительных ресурсов северо-восточной территории Российской Федерации. Объектами исследования нами выбраны Змееголовник якутский (Dracocephalum jacutense Peschkova) 1 категория, Лилия кудреватая (Lilium pilosiusculum (Freyn) Miscz. [L. martagon L.]) 2б категория, Полынь Мартьянова (Artemisia obtusiloba Ledeb. subsp. martjanovii (Krash. ex Poljak.) Krasnob. 3д категория, - растения, внесенные в «Красную книгу Республика Саха (Якутия)» (Т. 1, 2017), которые исчезают, сокращены в численности, крайне редко встречаются, с ограниченным ареалом, обладают узколокальными местами обнаружения. Данные виды растений культивируются в условиях Ботанического сада СВФУ и Якутского Ботанического сада ИБПК СО РАН более 10 лет. Однако, даже прохождение полного фенологического цикла, затрудняет размножение данных видов в условиях открытого грунта. Таким образом, интактные растения имеют огромные шансы на исчезновение с местонахождений, а сохраняемые в культуре образцы дают скудный самосев и ничтожно малый семенной материал. По данным видам редких растений отсутствуют какие-либо научные источники по их фитохимическому профилю, виды растений могут исчезнуть без изучения возможного ценного биологически активного потенциала. Стандартизированные протоколы получения генетически и фитохимически стабильных микроклонов исчезающих и редких растений сформируют основу для социально-экономических биотехнологий. Результаты проекта будут доложены на научно-практических конференциях регионального, всероссийского и международного уровней в виде устных докладов, апробированы на выставках научно-инновационных проектов в области биотехнологии растений. По результатам, получаемым в ходе выполнения проекта, будет опубликовано 8 статей в рецензируемых российских и зарубежных журналах.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Разгонова М.П., Охлопкова Ж.М., Рожина З.Г., Егорова П.С., Голохваст К.С. Comparison of Wild and Introduced Dracocephalum jacutense P.: Significant Differences of Multicomponent Composition Horticulturae (год публикации - 2022)

2. Охлопкова Ж.М., Разгонова М.П., Егорова П.С., Голохваст К.С. Характеристика комплекса полифенольных соединений эндемика Якутии Dracocephalum jacutense Peschkova с использованием метода тандемной масс-спектрометрии Физиология растений (Russian Journal of Plant Physiology) (год публикации - 2023)

3. Охлопкова Ж.М., Разгонова М.П., Рожина З.Г., Егорова П.С., Голохваст К.С. Dracocephalum jacutense Peschkova from Yakutia: extraction and mass spectrometric characterization of 128 chemical compounds Molecules, Т. 28, Вып. 11, 4402 (год публикации - 2023)
10.3390/molecules28114402

4. Охлопкова Ж.М., Разгонова М.П., Кучарова Е.В., Егорова П.С., Голохваст К.С. Редкое растение Центральной Якутии Polygala sibirica L.: фитохимический профиль и получение морфогенной культуры in vitro Физиология растений, Т. 70, №7 (год публикации - 2023)
10.31857/S0015330323600973

5. Охлопкова Ж.М., Эркисли С., Разгонова М.П., Иванова Н.С., Антонова Е.Е., Егоров Ю.А., Кучарова Е.В., Голохваст К.С. Primary determination of the composition of secondary metabolites in wild and introduced Artemisia martjanovii Krasch.: samples from Yakutia Horticulturae, 9(12). 1329 (год публикации - 2023)
10.3390/horticulturae9121329

6. Егоров Ю.А., Алаганчакова Л.В., Заболоцкая А.П., Охлопкова Ж.М. Генотипирование представителей рода Artemisia, произрастающих на территории Якутии Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии, Т. 23, № 2. С. 86-91. (год публикации - 2024)
10.14258/pbssm.2024068

7. Охлопкова Ж.М., Разгонова М.П., Егорова П.С., Голохваст К.С. Polyphenolic Complex of the Above-Ground Phytomass of Dryopteris fragrans (L.) Schott. from Yakutia: Supercritical Carbon Dioxide Extraction and Identification by Tandem Mass Spectrometry Russian Journal of Plant Physiology (год публикации - 2025)

8. Охлопкова Ж.М., Охлопкова Т.М., Гуляев И.Р., Якименко А.С., Кучарова Е.В. Особенности обработки семян редких и исчезающих видов растений Якутии к культивированию in vitro Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии, Т. 23, № 2. С. 298-302. (год публикации - 2024)
10.14258/pbssm.2024108

9. Антонова Е.Е., Алексеев С.С., Протопопова А.Е., Охлопкова Ж.М. Фитоценотическая характеристика местообитаний Dracocephalum jacutense Peschkova на территории Якутии Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии, Т. 23, № 2. С. 10-14. (год публикации - 2024)
10.14258/pbssm.2024054

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
При переносе стерильных проростков Dracocephalum jacutense (D.j.) на МС с добавлением ТДЗ (1 мг/л) и ГК (0,5 мг/л) инициировано активное побегообразование in vitro. А при культивировании стерильных проростков Dr.j. на МС с добавлением БАП (1 мг/л) и ГК (0,5 мг/л) инициировано образование удлиненных стеблей. При переносе стерильных проростков Dr.j. на МС с добавлением ИМК (1 мг/л) через 30 сут наблюдали усиленное развитие корневой системой. На основе корневых эксплантов получены первичные каллусы Dr.j на МС с добавлением 2,4-Д (1 мг/л), БАП (1 мг/л), НУК (1 мг/л). На стабильно растущих каллусных культурах Dr.j. изучена динамика роста сырой и сухой биомассы на разных питательных средах. Выполнено масштабирование получения микрорастений Lilium pilosiusculum (L.p.). Размноженные микропобеги L.p. переносили на МС с добавлением ИМК (1 мг/л) для инициации ризогенеза, роста и развития побегов и листьев. Микрорастения L.p. адаптировали к условиям почвенного субстрата, затем передавались для изучения адаптации к условиям открытого грунта в Ботсад. При пересадке в открытый грунт микрорастения L.p давали рост новых листьев, что свидетельствовало о развитии корневой системы. Выполнено масштабирование получения микрорастений Polygala sibirica (P.s.). Микрорастения P.s. с интенсивным побегообразованием получены путем непрямого морфогенеза in vitro на каллусных культурах на МС с добавлением БАП (1 мг/л). Ризогенез микрорастений P.s. инициировали при культивировании на МС с добавлением ИМК (1 мг/л). Изучено влияние суспензии оксида графена на развитие корней микрорастений P.s. при адаптировании к условиям почвенного субстрата. Выполнено масштабирование получения микрорастений Artemisia martjanovii (A.m.). Культивирование микрорастений A.m. было эффективно на МС с добавлением БАП (1 мг/л). Микрорастения A.m. пересаживали на МС с добавлением НУК (1 мг/л) для инициации ризогенеза. Изучено влияние суспензии оксида графена на развитие корней микрорастений A.m. при адаптировании к условиям субстрата. Укорененные микрорастения A.m. переданы для адаптации к условиям открытого грунта в Ботсад. Разработан протокол поверхностной обработки и стерилизации семян к введению Thermopsis jacutica (T.j.) в культуру in vitro. При пересадке 2-х-недельных проростков T.j. на МС с добавлением БАП (1 мг/л) через 14 сут наблюдалось активное побегообразование, на которых через две недели наблюдался каллусогенез. При пересадке стерильных проростков на МС с добавлением НУК (1 мг/л) наблюдается побегообразование, развитие микропобегов. На стабильно растущих каллусных культурах T.j. изучена динамика роста биомассы на разных питательных средах. Наиболее эффективный прирост биомассы каллусов T.j. наблюдается при культивировании на МС с добавлением 2,4-Д (0,95 мг/л), БАП (1 мг/л) и НУК (1 мг/л), где прирост сырой массы составил 3,01 г, сухой массы – 0,14 г. Разработан протокол поверхностной обработки и стерилизации семян Adonis sibirica (A.s.). Инициировано получение стерильных проростков A.s. Листовые экспланты из интактного растения A.s. высаживали на МС с добавлением 2,4-Д, НУК, кинетина (по 1 мг/л) и на МС с добавлением 2,4-Д, БАП и НУК (по 1 мг/л) для введения растения в культуру in vitro. Изучено строение семян Krascheninnikovia lenensis (K.l.) под световым бинокуляром. Разработан протокол для поверхностной обработки и стерилизации семян K.l. После обработки семена посажены на безгормональную МС для получения стерильных проростков. Изучен генетический полиморфизм в образцах стерильных проростков, дикорастущих и интродуцированных растений, клеточных культур, микрорастений D.j., L.p., A.m. с помощью RAPD-ПЦР анализа. По результатам анализа электрофореграммы амплифицированных ДНК отмечается идентичность среди образцов стерильных проростков и дикорастущих растений D.j., среди образцов стерильных проростков, микрорастений и дикорастущих растений L.p., среди образцов интродуцированных, дикорастущих растений и микрорастений A.m. Выделены и сохранены образцы геномной ДНК из фитомассы дикорастущих растений T.j., A.s., K.l. при -20 °C для дальнейших исследований. С помощью ВЭЖХ и МС/МС изучен фитохимический профиль надземной фитомассы Lilium pilosiusculum. В метанольных экстрактах из листьев Lilium pilosiusculum идентифицировано 69 соединений, из них 40 – представляют полифенольную группу. 42 химических соединения были впервые идентифицированы в семействе Liliaceae, из них 24 соединения – это полифенолы. В результате проведенного масс-спектрометрического исследования в надземной фитомассе Adonis sibirica идентифицировано 75 соединений, из них 55 представляют полифенольную группу. 32 химических соединения были впервые идентифицированы в надземной фитомассе Adonis sibirica, из них 25 – полифенолы. Были изучены БАВ в метанольных, этанольных и сверхкритических СО2-экстрактах из надземной фитомассы Dryopteris fragrans (L.) Schott. методами ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Идентифицировано 140 химических соединений, из них 85 полифенольной группы. 52 соединения впервые идентифицированы в семействе Dryopteris, из них 34 – полифенолы. Были организованы и проведены экспедиционные работы на территории Намского, Хангаласского, Амгинского районов РС(Я) по учету распространенности изучаемых видов редких и исчезающих растений, по сбору растительного материала в течение июня, июля, августа и сентября 2024 г. С результатами исследований по проекту приняли участие в семи научно-практических конференциях всероссийского и международного уровней, в т. ч. с 4 устными докладами. Руководителем проекта был представлен доклад по проекту в рамках Всероссийского Лектория «10 лет с РНФ» в «Точке кипения» СВФУ (сентябрь, 2024 г.). По результатам работы опубликовано 3 статьи в журнале, индексируемом в РИНЦ, принята к публикации 1 статья в журнал БД (Scopus), подана к публикации 1 статья в журнал WoS (Q1).

Публикации

Возможность практического использования результатов
В настоящее время стало ясным, что следует обратить внимание на поиск новых соединений, в т.ч. интересных видоспецифичных вторичных метаболитов, синтезируемых и аккумулируемых в разрабатываемых культурах клеток растений, которые представляет ценное растительное лекарственное сырье для разработки новых лекарственных средств. Растения Якутии, произрастающие в условиях резко-континентального климата, вечной мерзлоты, короткого вегетационного периода, высокой сезонной и суточной амплитуды температур, характеризуются не только стресс-адаптационным потенциалом, но и высоким содержанием биологически активных веществ, включая и вторичные метаболиты. Культура клеток высших растений может служить альтернативным способом изготовления фитосырья для медицины, ветеринарии, парфюмерии и пищевой промышленности. В ряде случаев биомасса клеток in vitro превосходит по свойствам полученную от природного или плантационного растения. Культура клеток также оказывается незаменимой в том случае, когда необходимо произвести сырье редких или исчезающих видов лекарственных растений. Полученные разработки технологии клонального микроразножения in vitro редких и исчезающих видов растения Республики Саха (Якутия) по видам Lilium pilosiusculum, Polygala sibirica и Artemisia martjanovii позволяют сохранить исчезающие виды и дают возможность изучать свойства в условиях лаборатории. Также введенные в культуру in vitro редкие виды Dracocephalum jacutense и Thermopsis jacutica способствуют сохранению и изучению в условиях лаборатории. Dracocephalum jacutense, Polygala sibirica, Artemisia martjanovii, и Thermopsis jacutica широко используются в народной медицине в виду того, что данные виды растений богаты вторичными метаболитами. Благодаря технологии in vitro культур клеток этих видов растений в дальнейшем можно использовать в медицине без риска причинения вреда дикорастущим популяциям. По результатам наших исследований у Dracocephalum jacutense обнаружены флавоноиды, изофлаванон, фенилпропановая кислота, гидроксикоричные кислоты, лигнаны, гидроксикумарины, кумарины кумаринглюкозид, гидроксибензойная кислота и дигидрохалкон, которые придают свойства во многом схожие с другим видом Dr. palmatum, экстракты которого обладают в т.ч. противоопухолевой активностью. Термопсис якутский содержит ряд алкалоидов (термопсин, гомотермопсин, метилцитизин, пахикарпин, анагирин), а также дубильные вещества, сапонины, смолы и витамин С. Содержащиеся в растении биологически активные вещества обладают ганглиоблокирующими свойствами. Термопсис якутский используют как отхаркивающее средство, стимулятор дыхания и кровообращения. Содержание алкалоидов в растениях якутской популяции термопсиса выше, чем в растениях из других регионов. Истод сибирский содержит в себе тритерпеновые сапонины, жирное масло, виноградный сахар, спирт, смолы, эфирное масло, валерьяновую кислоту и салициловокислый метиловый эфир. Сапонины обладают отхаркивающим действием, они повышают секрецию слюнных и слизистых желез, разжижают слизь. В связи с этим в народной медицине широко применяется при острых и хронических заболеваниях органов дыхания: при бронхитах, ларингитах, бронхиальной астме. Полученные in vitro каллусные культуры клеток объектов исследования в дальнейшем могут составить основу к получению лекарственного растительного сырья и быть востребованными для прикладных целей фармацевтической промышленности и биомедицины. Клональное микроразмножение растений также является перспективным направлением не только для сохранения генофонда редких и исчезающих видов, но и для получения растений устойчивых к определенным условиям и факторам. Соответствующие разработки с привлечением данной технологии можно внедрять для получения новых сортов сельскохозяйственных растений с улучшенными качествами для климатической зоны северных и арктических территорий. Полученные при выполнении проекта результаты, а также разработанные технологии могут быть востребованы и использованы в образовательном процессе при подготовке кадров в области клеточной биологии, биотехнологии растений, генетике и генной инженерии. А также могут быть использованы для элективных и факультативных курсов для талантливых школьников при выполнении проектных работ и разработок.