Нуклеосомы-зонды как инструмент поиска новых регуляторов системы эксцизионной репарации оснований ДНК

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-74-10059

НазваниеНуклеосомы-зонды как инструмент поиска новых регуляторов системы эксцизионной репарации оснований ДНК

Руководитель Кутузов Михаил Михайлович, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук , Новосибирская обл

Конкурс №71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые слова нуклеосомы, хроматин, система эксцизионной репарации оснований, аффинная модификация, FRET, мишени для терапии

Код ГРНТИ31.27.15

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Предлагаемый проект посвящен выявлению и изучению белков, способных взаимодействовать с нуклеосомами, содержащими в своей структуре ДНК-интермедиаты системы эксцизионной репарации оснований. Такой подход позволит частично учесть влияние организации хроматина на функционирование системы BER. Кроме того, идентификация белков, оказывающих влияние на эффективность системы BER на нуклеосоме, позволит выявить ранее неизвестные регуляторные факторы этой системы репарации. Известно, что нуклеосомная организация сама по себе, а также возможность перестройки структуры хроматина, влияют на эффективность работы большинства ферментов системы BER. Функционирование некоторых негистоновых белков хроматина может дополнительно оказывать влияние на изменение степени компактизации ДНК и, как следствие, на спектр белков, взаимодействующих с нуклеосомным зондом. Фракционирование экстрактов ядер клеток с целью их обогащения по белкам, взаимодействующим с хроматином, позволит выявить минорные белок-нуклеиновые контакты. Выполнение проекта основывается на применении аффинной модификации с использованием нуклеосом-зондов, реконструированных на основе ДНК с реакционноспособными группами. В качестве реакционноспособных групп будут использованы АР-сайты и/или комбинация повреждения ДНК и фотоактивируемой группы. Ранее в нашей лаборатории были отработаны подходы по использованию ДНК-зондов с такими группами для идентификации белков, взаимодействующих с повреждениями, имитирующими интермедиаты BER. В качестве основного метода при идентификации продуктов аффинной модификации будет использован метод MALDI-TOF-MS. Высокие показатели чувствительности и специфичности этого метода позволяют идентифицировать продукт «пришивки», содержащийся в низкой концентрации и/или в составе сложной смеси, например, среди других компонентов экстракта клеток. Оригинальность работы заключается в применении нуклеосомных частиц в качестве зондов, а также в использовании фракционированных экстрактов ядер культур клеток человека для поиска регуляторных белков системы репарации. Выполнение предлагаемого проекта позволит углубить понимание регуляции процесса BER на нуклеосомах, что представляет как фундаментальный, так и практический интерес для поиска ингибиторов систем репарации, потенциальных антираковых препаратов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Украинцев А.А., Кутузов М.М., Белоусова Е.А., Жуайо М., Голышев В.М., Ломзов А.А., Лаврик О.И. PARP3 Affects Nucleosome Compaction Regulation MDPI, N24, V10, P9042 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24109042

2. Украинцев А.А., Кутузов М.М., Лаврик О.И. Studying Structure and Functions of Nucleosomes with Atomic Force Microscopy Biochemistry (Moscow), Vol. 89, No. 4, pp. 674-687 (год публикации - 2024)
10.1134/S0006297924040072

3. Кутузов М.М., Сайфуллина Д.И., Белоусова Е.А., Лаврик О.И. HPF1 Regulates Pol β Efficiency in Nucleosomes via the Modulation of Total Poly(ADP-Ribose) Synthesis International Journal of Molecular Sciences (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.3390/ijms26051794

4. Кутузов М.М. , Белоусова Е.А., Дрейман В.М., Лаврик О.И. АП-сайт не вносит существенных искажений в структуру ДНК в составе нуклеосомы БИОХИМИЯ, БИОХИМИЯ, 2025, том 90, вып. 8, с. 1219 – 1228 (год публикации - 2025)
10.31857/S0320972525080118

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В ходе реализации проекта в 2024-2025 гг. основное внимание было уделено поиску белков ядерных экстрактов, специфически взаимодействующих с АР-сайтами в составе компактизованной формы ДНК, реконструированной на основе нуклеосом-позиционирующей последовательности клон Widom 603. Нуклеосомы-зонды содержащали АР-сайт, две метки – радиоактивную и флуоресцентную, а также молекулу биотина на одном из 5'-концов ДНК. В данном случае АР-сайт, с одной стороны, является специфическим повреждением ДНК, а, с другой, позволяет провести аффинную модификацию взаимодействующих с повреждением белков группой с нулевой длиной линкера. Флуоресцентная и радиоактивная метки позволяют отслеживать конкретный аддукт, а биотин необходим для обогащения фракции целевых аддуктов для последующей идентификации продуктов модификации методом MALDI масс-спектрометрического анализа. К сожалению, введение стадии обогащения не привело к идентификации новых белков среди белок-нуклеиновых аддуктов. Основные продукты модификации имели ту же электрофоретическую подвижность ~80 кДа, ~40 кДа и ~18 кДа. Были идентифицированы большая субъединица Ku-антигена, компонент репликативной геликазы Mcm7, нуклеоплазмин, шаперон H3, H2B, H4 и регулятор активности АРЕ1 на дц-АР-ДНК, мультифункциональный белок SET и негистоновый белок хроматина HMGB1. Дополнительно в течение отчетного периода была исследована возможность искажения вторичной структуры ДНК в составе NCP за счет наличия АР-сайта. Для этого был использован химический футпринтинг с помощью реактива Фентона. Несмотря на все предпосылки, результаты проделанной работы не выявили критических изменений в профиле расщепления THF-ДНК по сравнению с ее нативной формой в составе нуклеосомы. Кроме того, в течение отчетного периода была исследована активация PARP1 и PARP2 в присутствии HPF1 модельными ДНК как в свободной форме, так и в составе нуклеосомы. В частности, получены биохимические данные об активности белков PARP1 и PARP2, указывающие на существенную роль комплекса PARP2 с HPF1 в регуляции стадии синтеза ДНК ДНК-полимеразой бета при коротко- и длиннозаплаточном путях BER на нуклеосоме. С использованием микроскопии FRET было показано, что связывание PARP2 с нуклеосомой может приводить к изменениям в структуре NCP. Более того, оказалось, что синтез поли(ADP-рибозы), катализируемый PARP2, в том числе в присутствии HPF1, приводит к уменьшению эффективности сигнала FRET, не доходя при этом до уровня полностью декомпактизованной частицы. Таким образом, на основании совокупности полученных и литературных данных можно говорить о существенной дестабилизации NCP без потери гистонов комплексом PARP2/HPF1 в условиях PARилирования. Попытки изучения структуры поли(ADP-рибозы) в составе комплекса с нуклеосомой методом атомно-силовой микроскопии привели к необходимости корректировки конструкции ДНК-субстрата в сторону хроматиноподобной структуры. Были реконструированы и разрешены полинуклеосомы, содержащие 8 нуклеосом. Примечательно, что при использовании таких хроматиноподобных структур не удалось зарегистрировать существенных изменений в геометрии отдельных NCP в составе комплексов с PARP1 или PARP2. Сопоставляя эти результаты с данными FRET-спектроскопии можно предположить, что взаимодействие PARP2 c NCP приводит к минорным искажениям геометрии коровой частицы, вероятно, необходимым для тонкой регуляции структуры.

Публикации