Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Основное направление научной работы включает моделирование и экспериментальные исследования молекулярных процессов. Используя программные комплексы GROMACS 2020.1 и Python-библиотеку OpenMM выполнено моделирование взаимодействий криопротекторов с водой и клеточными мембранами. Параметризация проводилась с применением сайта LigParGen (силовое поле OPLS-AA), а TIP4P/Ice использовалась как модель воды. В ходе симуляций исследованы структурные и термодинамические параметры систем, включая гидрофильные свойства, остаточное содержание свободной воды и температурные характеристики криопротекторов. Для оценки криопротекторных свойств соединений были использованы две метрики: функция углового распределения (ADF) и функция радиального распределения (RDF). На основании расчетных данных выявлены основные критерии оценки действия криопротекторов. Например, ДМСО обладает наибольшей способностью связываться с водой, что свидетельствует о его выраженном осмотическом свойстве. Для дисахаридов, таких как сахарозы, трегалозы, показана высокая термическая устойчивость, что делает их перспективными для криоконсервации. Кроме того, методами квантовой химии, используя DFT расчеты с применением функционала B3LYP изучены термодинамические свойства взаимодействий молекул криопротекторов с водой. Рассчитанные энергии Гиббса сольватации позволяют на ранних стадиях исследований оценить эффективность различных соединений для обеспечения стабильности биологических систем при замораживании [https://ojs.altstu.ru/index.php/PolzVest/article/view/595, Ashikhmina M, et al A DFT-based analysis of bacterial preservation efficiency на рецензировании Food Research International]. На основе полученных данных было выявлено, что эффективность криопротектора обратно пропорциональна изменению энергии Гиббса: чем меньше это изменение при заданной температуре, тем эффективнее соединение. Метод особенно эффективен для оценки непроникающих криопротекторов, подтверждая их значимость в биотехнологических процессах, в том числе и при получении для заквасочных культур пищевой отрасли. Были проведены лабораторные исследования с молочнокислыми бактериями для оценки влияния криопротекторов на выживаемость бактерий и синтез молочной кислоты после криоконсервации [статья Osmak O., Ashikhmina M, et al Digital tracking of pH changes and growth of lactic acid bacteria using bromocresol purple на рецензировании Microchemical Journal]. Установлено, что использование сахарозы и трегалозы увеличивает выживаемость клеток на 30–40% по сравнению с контролем. Композиции с добавлением полиэтиленгликоля и цистеина повышали эффективность криопротекции, предотвращая кристаллизацию воды и способствуя формированию аморфной структуры льда. Экспериментально подтверждено, что стабильность криопротекторов сохраняется при низких температурах до шести месяцев, однако высокая влажность требует улучшенной герметизации при хранении. Подбор композиций осуществлялся с учетом их свойств, таких как осмотические способности к формированию водородных связей и влияние на термодинамические характеристики системы. В качестве основных модельных веществ были использованы следующие: сахароза, трегалоза, глюкоза, глицерин, диметилсульфоксид (ДМСО), полиэтиленгликоль (ПЭГ) и цистеин. Данные вещества были выбраны из-за следующих характеристик: ДМСО и глицерин являются проникающими криопротекторами, которые обеспечивают защиту клеточных структур регулируя осмотическое давление; сахароза, трегалоза и глюкоза, являясь непроникающими криопротекторами, предотвращают образование крупных кристаллов льда за счет формирования аморфного льда и стабилизируют внешние клеточные структуры. Были составлены и исследованы следующие композиции: смесь сахарозы и трегалозы с добавлением ПЭГ; смесь ДМСО, глицерина и трегалозы; смесь сахарозы, цистеина и ПЭГ; смесь сахарозы, трегалозы, глицерина и цистеина. На основании проведенных исследований было определено, что использование смесей криопротекторов, объединяющих проникающие и непроникающие криопротекторы, позволяет добиться синергетического эффекта, повышая выживаемость клеток на 30–50% по сравнению с "чистыми" криопротекторами. Композиция, состоящая из трегалозы, глицерина и ПЭГ предотвращает образование крупных кристаллов льда, защищает клеточную мембрану, что приводит к повышению выживаемость до 30%. В то же время композиция из трегалозы, ПЭГ и цистеина, увеличивали выживаемость клеток на 40% за счет уменьшения осмотического давления и снижали степень окислительного повреждения. Также разработан алгоритм обработки научных публикаций, позволяющий автоматически извлекать информацию о криопротекторах и бактериях, упомянутых в тексте. В алгоритм обработки интегрирована нейросеть GPT, которая позволяет обрабатывать широкий круг публикаций. В отличие от традиционных методов, таких как поиск по ключевым словам или тематическое моделирование, этот метод показывает высокую точность в работе с большим объемом научной информации. Для удобства использования алгоритм представлен в виде Telegram-бота (https://t.me/chemical_assist_bot), что позволяет быстро получать структурированные данные в формате списков криопротекторов и бактерий [Статья LARGE LANGUAGE MODEL FOR AUTOMATING THE ANALYSIS OF CRYOPROTECTANTS M. S. Ashikhmina, A. M. Zenkin, A. O. Ivanova, I. R. Pavlishina, O. Y. Orlova, I. S. Pantiukhin, E. V. Skorb, Journal of Chemical Information and Modeling]. В рамках исследований была создана методика измерения уровня pH и динамики роста бактерий с использованием фотографий, полученных на камеру телефона с последующим анализом алгоритма, интегрированным в TG-бот. Основной инструмент системы – индикатор бромкрезоловый пурпур, цвет которого меняется в зависимости от уровня кислотности среды. В ходе исследования проводились эксперименты с использованием типового штамма Streptococcus thermophilus. Для точности работы алгоритма была построена калибровочная кривая, показывающая зависимость между концентрацией молочной кислоты и оптической плотностью среды при длинах волн 430 нм и 590 нм. Этот подход позволил обеспечить точность измерений и возможность прогнозировать динамику роста при использовании бромкрезолового пурпурного. Автоматизация процесса мониторинга позволяет сократить временные и финансовые затраты при контроле стадий культивирования бактерий, что позволяет получать стабильное качество с высокой степенью воспроизводимости процесса ферментации. При работе с бактериальными культурами это позволяет минимизировать вероятность ошибок при проведении экспериментов [По материалам написана статья DIGITAL TRACKING OF PH CHANGES AND GROWTH OF LACTIC ACID BACTERIA USING BROMOCRESOL PURPLE O. O. Osmak, M. S. Ashikhmina, A. M. Zenkin, I. K. Latyshenok, V. S. Filozop, M. O. Volodarskiy, O. Yu. Orlova, I. S. Pantiukhin, S. A. Ulasevich, E. V. Skorb]

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В отчетном периоде выполнен комплекс исследований, направленных на формирование научно обоснованного инструментария для прогнозирования эффективности криопротекторов и оптимизации условий низкотемпературного хранения бактериальных культур. Работы включали математическое моделирование, проведение молекулярно-динамических (МД) и квантово-химических (DFT) расчетов, а также формирование базы данных и проведение экспериментальной оценки полученных результатов. Основное направление научной работы было направлено на разработку модели оценки выживаемости бактерий. Модель описывает влияние физических, химических и биофизических факторов, возникающих при замораживании и криоконсервации на выживаемость бактерий. Происходит учет параметров температурного профиля, типа и концентраций криопротекторов, а также анализируются характеристики среды и скрытые внутриклеточные состояния, которые определяют чувствительность клетки к повреждающим воздействиям. Модель формализует основные направления криоповреждений, такие как формирование льда, осмотические, механические и химические, затем преобразует их в нормированные безразмерные риски, которые используются для расчета итоговой вероятности выживания клетки. Для различных классов криопротекторов разработаны отдельные функциональные модули. Каждый модуль отражает специфические механизмы действия: непроникающие криопротекторы стабилизируют мембрану и регулируют внешнюю гидратацию; проникающие соединения формируют внутреннюю защиту и частично замещают воду; антиоксиданты уменьшают чувствительность клетки к окислительному стрессу [https://gitlab.com/biotechnology-modeling/cpa_model]. Первичная калибровка алгоритма по экспериментальным данным показала хорошее соответствие расчетных значений выживаемости с наблюдаемыми, что подтвердило корректность используемых зависимостей и весовых коэффициентов. Параллельно проведено МД для исследования влияния пяти «классических» применяемых криопротекторов на структурные свойства модельного липидного бислоя POPC. Получено, что трегалоза и ДМСО вызывают уплотнение мембраны, увеличивая ее толщину и снижая площадь на липид, тогда как сахароза, глюкоза и глицерин приводят к разрыхлению. При этом трегалоза локализуется у поверхности мембраны и действует «мягко», без глубокого проникновения, тогда как ДМСО взаимодействует с головными группами липидов и изменяет их ориентацию. Глюкоза и глицерин образуют значительное число водородных связей с мембраной, что может нарушать гидратационный слой и структуру бислая. Эти данные позволили количественно оценить молекулярные механизмы действия разных криопротекторов и сопоставить их с известными экспериментальными эффектами [подготовлена статья Multilevel analysis of the molecular mechanisms of the effect of cryoprotectors on the structure and properties of lipid membranes]. Дополнительно выполнены квантово-химические расчеты свободных энергий сольватационных кластеров и проведен анализ нековалентных взаимодействий (NCI/RDG) для оценивания устойчивости гидратных оболочек криопротекторов. Установлено, что сахароза формирует наиболее развитую сеть водородных связей и значительно структурирует воду; глюкоза и глицерин проявляют умеренную способность к организации гидратационной оболочки; ДМСО демонстрирует минимальную способность к структурированию воды и формирует преимущественно дисперсионные и дипольные взаимодействия. Эти результаты согласуются с различиями в криозащитных свойствах изученных веществ [принята статья Molecular mechanisms for evaluating cryoprotectants in food biotechnology (в печати)]. На основе полученных данных сформирована интегрированная база, объединяющая физико-химические характеристики криопротекторов, результаты квантово-химических и молекулярно-динамических расчетов и экспериментальные данные по выживаемости бактерий [https://docs.google.com/spreadsheets/d/1J5dZlxPZOfoajv34cXTKshrSxgXU0kKg1yyJkGP-y50/edit?usp=sharing]. База данных обеспечивает представление свойств криопротекторов и служит основой для последующего применения методов машинного обучения. Экспериментальная часть работы была направлена на проверку модели и уточнение ее параметров. Полученные данные подтвердили корректность описания защитного действия основных классов криопротекторов и выявили направления доработки модели, включая необходимость учета полимерных добавок и влияния медленного охлаждения. Результаты отчетного периода обеспечили создание многоуровневой научной платформы, объединяющей моделирование, молекулярные расчеты и экспериментальные данные, что формирует основу для дальнейшего развития предиктивных подходов к криоконсервации бактериальных культур.