Биотехнологический синтез белка одноклеточных и разрушаемых биопластиков с использованием в качестве нового углеродного субстрата жиросодержащих отходов технологий рыбопереработки: фундаментальное обоснование и реализация

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-64-10007

НазваниеБиотехнологический синтез белка одноклеточных и разрушаемых биопластиков с использованием в качестве нового углеродного субстрата жиросодержащих отходов технологий рыбопереработки: фундаментальное обоснование и реализация

Руководитель Волова Татьяна Григорьевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук" , Красноярский край

Конкурс №82 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (междисциплинарные проекты)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые слова биотехнологический синтез, целевые продукты, белок одноклеточных, разрушаемые биопластики, субстраты, жиросодержащие отходы рыбопереработки, состав отходов, полнота утилизации, структура и свойства целевых продуктов, новые биотехнологии, Технические условия, Исходные данные, масштабирование,

Код ГРНТИ62.09.99

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Научная проблема, на решение которой направлен проект, заключается в фундаментальном обосновании, разработке и реализации технологий получения целевых биотехнологических продуктов (белка одноклеточных и разрушаемых биопластиков) за счет использования отходов рыбопереработки в качестве нового источника углеродного сырья. Актуальность и значимость этой междисциплинарной научной проблемы обоснованы вызовами, которые включают дефицит социально значимых целевых продуктов, включая белок одноклеточных и разрушаемые экологически чистые материалы нового поколения на фоне нарастающих глобальных экологических проблем. Для решения проблемы, наряду с традиционными технологиями и средствами, все большее значение имеют технологии, препараты и материалы, получаемые в процессах биотехнологии. Однако масштабность и экономическая целесообразность биотехнологических процессов во многом определяется ресурсами доступных субстратов, что делает актуальным привлечение новых субстратов, включая отходы. Крупнотоннажным и возобновляемым ресурсом для получения субстратов биотехнологии в проекте рассматриваются жиросодержащие отходы пищевых технологий рыбопереработки. Малоизученность этого субстрата делает необходимым проведение фундаментальных исследований для повышения эффективности технологий рыбопереработки и использование отходов не только для получения рыбной муки, но более востребованных продуктов с высокой добавленной стоимостью. К таковым относятся белок одноклеточных и разрушаемые микробные пластики. Новизна проекта обусловлена неисследованной возможностью применения жиросодержащих отходов рыбопереработки в качестве нового углеродного субстрата биотехнологии для получения белка одноклеточных и разрушаемых биопластиков. Заявленный инновационный и междисциплинарный проект аналогов не имеет и на сегодняшний день – вне конкуренции. Междисциплинарный проект направлен на фундаментальное обоснование, разработку и реализацию новых биотехнологий биосинтеза белка одноклеточных и разрушаемых биопластиков за счет использования нового углеродного субстрата (отходов пищевой рыбопереработки), его реализация требует объединения знаний, потенциала, подходов, специалистов различных отраслей знаний: «04 Биология и науки о жизни» (04-209 Биотехнология (в том числе бионанотехнология)) и «06-Сельское хозяйство» (06-301 Технология пищевых продуктов). Заявитель проекта Институт биофизики СО РАН имеет компетенции и сильные научные заделы в области «белой» биотехнологии, относящиеся к отрасли: «04 Биология и науки о жизни» (04-209 Биотехнология (в том числе бионанотехнология)) в части разработки и исследования продуцирующих микробных биосистем, биотехнологического синтеза целевых продуктов, включая белок одноклеточных и разрушаемые биопластики полигидроксиалканоаты, и ориентирован на расширение сырьевой базы и поиск новых доступных субстратов. Для исследования жиросодержащих отходов рыбопереработки, отличающихся видовым разнообразием, высокой вариативностью химического состава и нестабильностью качества, как основы для разработки эффективных технологий их переработки, в качестве партнера в проекте участвует Калининградский государственный технический университет, один из ведущих университетов России в области исследований рыбных ресурсов и ориентированный на поиск новых областей применения отходов для получения новых ценных продуктов; его компетенции и научные результаты лежат в области: «06-Сельское хозяйство» (06-301 Технология пищевых продуктов). Объединение потенциала двух научных коллективов – Института биофизики СО РАН и Калининградского государственного технического университета будет использовано для выполнения заявляемого междисциплинарного проекта. Научные знания и компетенции, созданные заделы и сформировавшийся опыт сотрудничества в данных направлениях исследований обеспечат успешное решение всех сформулированных задач заявляемого междисциплинарного проекта.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Волова Т. Г., Успенская М. В., Киселев Е. Г., Суковатый А. Г., Жила Н. О., Васильев А. Д., Шишацкая Е. И. Effect of Monomers of 3-Hydroxyhexanoate on Properties of Copolymers Poly (3-Hydroxybutyrate-co 3-Hydroxyhexanoate) Polymers, 5(13):2890 (год публикации - 2023)
https://www.mdpi.com/2073-4360/15/13/2890

2. Жила Н. О., Сапожникова К. Ю., Киселев Е. Г., Шишацкая Е. И., Волова Т. Г. Synthesis and Properties of Polyhydroxyalkanoates on Waste Fish Oil from the Production of Canned Sprats Processes, 11(7):2113 (год публикации - 2023)
10.3390/pr11072113

3. Киселев, Е. Г., Демиденко, А. В., Барановский, С. В., & Волова, Т. Г. Выделение и очистка полигидроксиалканоатов. Масштабирование в условиях пилотного производства Журнал Сибирского федерального университета. Химия, Journal of Siberian Federal University. Chemistry 2023 16(3): 438–446 (год публикации - 2023)

4. Жила, Н. О., Волков, В. В., Мезенова, О. Я., Киселев, Е. Г., Волова, Т. Г. Отходы рыбопереработки – перспективный субстрат для синтеза целевых продуктов биотехнологии Журнал Сибирского федерального университета. Биология, Journal of Siberian Federal University. Biology 2023 16(3): 386–397 (год публикации - 2023)

5. Волова Т. Г., Жила Н. О., Киселев Е. Г., Суковатый А. Г., Лукьяненко А. В., Шишацкая Е. И. Biodegradable Polyhydroxyalkanoates with a Different Set of Valerate Monomers: Chemical Structure and Physicochemical Properties International Journal of Molecular Sciences, International Journal of Molecular Sciences. 2023; 24(18):14082 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms241814082

6. Жила Н. О., Киселев Е. Г., Волков В. В., Мезенова О. Ю., Сапожникова К. Ю., Шишацкая Е. И., Волова Т. Г. Properties of Degradable Polyhydroxyalkanoates Synthesized from New Waste Fish Oils (WFOs) International Journal of Molecular Sciences, International Journal of Molecular Sciences. 2023; 24(19):14919 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms241914919

7. Мезенова О.Я., Агафонова С.В., Романенко Н.Ю., Калинина Н.С., Волков В.В., Домбарович Л.В. Потенциал и перспективы использования жира из копченых рыбных отходов Известия КГТУ, Научный журнал «Известия КГТУ», № 70, С103-114 (год публикации - 2023)
10.46845/1997-3071-2023-70-103-114

8. Мезенова О.Я., Агафонова С.В., Романенко Н.Ю., Калинина Н.С., Волков В.В. Обоснование рациональных режимов технического выделения липидов из жиросодержащих рыбных отходов Журнал «Рыбное хозяйство», Рыбное хозяйство. 2023. № 4. С. 99-106 (год публикации - 2023)
10.37663/0131-6184-2023-4-99-106

9. Мезенова О. Я., Агафонова С. В., Романенко Н. Ю., Калинина Н. С., Волков В. В. Исследование процесса выделения жира из отходов рыбопереработки в качестве сырья для биотехнологического синтеза полигидроксиалканоатов Вестник Международной академии холода, Вестник Международной академии холода. 2024. № 1. С. 50-59 (год публикации - 2024)
1EYVedbqX8CXMZeEFme6NSEdeAH2w6FNBG

10. Мезенова О. Я., Агафонова С. В., Романенко Н. Ю., Калинина Н. С., Волков В. В., Киселев Е. Г., Жила Н. О., Дамбарович Л. В. Оценка потенциала липидов вторичного рыбного сырья в качестве биотехнологического субстрата для синтеза целевых продуктов Научный журнал «Известия КГТУ», Известия КГТУ. 2024. № 74. С. 78–91 (год публикации - 2024)
10.46845/1997-3071-2024-74-78-91

11. Ипатова Н.Д., Демиденко А.В. Биокомпозитный материал на основе биоразлагаемой матрицы из поли-3-гидроксибутирата и волокна древесины Материалы IV Международного биотехнологического форума «BIOAsia Altai», Материалы IV Международного биотехнологического форума «BIOAsia Altai» 2024. Т.4, № 4. С. 86-91 (год публикации - 2024)

12. Мезенова О.Я., Агафонова С.В., Романенко Н.Ю., Волков В.В., Калинина Н.С., Киселев Е.Г., Жила Н.О. Исследование качества и биологической ценности жира из отходов рыбопереработки в качестве субстрата для биотехнологического синтеза целевых продуктов Материалы II Международной научно-практической конференции «Рыбохозяйственный комплекс России: 300 лет российской академической науке», Материалы II Международной научно-практической конференции «Рыбохозяйственный комплекс России: 300 лет российской академической науке», Москва: Изд-во ВНИРО, 2024. – С. 518-523. (год публикации - 2024)

13. Киселев Е.Г., Демиденко А.В., Суковатый А.Г., Ипатова Н.Д., Прудникова С.В., Немцев И.В., Баяндин М.А., Ермолин В.Н., Волова Т.Г. Physicochemical, mechanical properties, and biodegradation studies of poly(3-hydroxybutyrate) composites reinforced with bacterial nanocellulose or wood flour Cellulose, Cellulose 31, 10303–10325 (2024) (год публикации - 2024)
10.1007/s10570-024-06212-0

14. Сапожникова К. Ю., Жила Н.О., Волова Т.Г. Потенциал жиросодержащих углеродных субстратов животного происхождения для биосинтеза "зеленых" пластиков Материалы IV Международного биотехнологического форума «BIOAsia Altai», Материалы IV Международного биотехнологического форума «BIOAsia Altai» 2024. Т.4, No 4. С. 571-575 (год публикации - 2024)

15. Мезенова О.Я., Агафонова С.В., Романенко Н.Ю., Калинина Н.С., Волков В.В., Дамбарович Л.В., Киселев Е.Г., Жила Н.О. Оценка перспективности использования липидов, ферментативно экстрагированных из рыбных отходов, в синтезе продуктов биотехнологии Материалы XII Международного Балтийского морского форума. XIII Национальная научно-практическая конференция с международным участием «Пищевая и морская биотехнология» Электронное издание., Материалы XII Международного Балтийского морского форума, Калининград: Изд-во БГАРФ, 2024. – С. 130-134. (год публикации - 2024)

16. Мезенова О.Я., Агафонова С.В., Романенко Н.Ю., Волков В.В., Калинина Н.С., Киселев Е.Г., Жила Н.О. Исследование показателей качества жира из вторичного рыбного сырья для его использования в биотехнологическом процессе получения биоразлагаемых полимеров Материалы Международной научно-практической конференции «Пищевая индустрия: инновационные процессы, продукты и технологии», посвящённая 20-летию Технологического института МСХА имени К.А. Тимирязева», Материалы Международной научно-практической конференции «Пищевая индустрия: инновационные процессы, продукты и технологии», посвящённая 20-летию Технологического института МСХА имени К.А. Тимирязева», Москва: Изд-во: Сам полиграфист, 2024. – С. 767-772. (год публикации - 2024)

17. Мезенова О. Я., Агафонова С. В., Романенко Н. Ю., Калинина Н. С., Волков В. В., Дамбарович Л. В., Федоров Д. С., Федорова О. С., Ячников Д. В. Исследования по оптимизации ферментативного процесса выделения жира из вторичного рыбного сырья для использования в биотехнологии Вестник Международной академии холода, Вестник Международной академии холода. 2024. № 3. С. 43-55 (год публикации - 2024)
1Cd1K9kF7HzBh2GqzABYEY3b14zRsSSZ4S

18. Жила, Н.О., Сапожникова К.Ю., Киселев Е.Г., Шишацкая Е.И., Волова Т.Г. Biosynthesis of Polyhydroxyalkanoates in Cupriavidus necator B-10646 on Saturated Fatty Acids Polymers, Polymers 2024, 16, 1294 (год публикации - 2024)
10.3390/polym16091294

19. Сапожникова К. Ю., Жила Н.О., Волова Т.Г. Waste fish oils (WFOs) as a substrate for the synthesis of ‘green’ bioplastics Public Health Toxicology, Public Health Toxicology 2024. Т. Supplement 2. А5. (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.18332/pht/191646

20. Сапожникова К. Ю. Отходы рыбопереработки как субстрат для микробиологического синтеза полигидроксиалканоатов Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2024», Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2024» / Отв. ред. И.А. Алешковский, А.В. Андриянов, Е.А. Антипов, Е.И. Зимакова. [Электронный ресурс] – М.: МОО СИПНН Н.Д. Кондратьева, 2024. (год публикации - 2024)

21. Мезенова О.Я., Агафонова С.В., Романенко Н.Ю., Калинина Н.С., Волков В.В., Киселев Е.Г., Жила Н.О. Оценка качества липидов вторичного рыбного сырья для применения в качестве субстрата для биотехнологического синтеза белков и полигидроксиалканоатов Материалы Всероссийской научно-практической конференции «БиоТех - 2024» Санкт-Петербург, Материалы Всероссийской научно-практической конференции «БиоТех - 2024» Санкт-Петербург: ПОЛИТЕХ-ПРЕСС, 2024. – С. 150. (год публикации - 2024)

22. Киселев Е.Г., Муруева А.В., Волков В.В., Воловa Т.Г. Влияние перемешивания и поверхностно-активных веществ на эмульгирование жировых отходов рыбопереработки в качестве потенциального биотехнологического углеродного субстрата Journal of Siberian Federal University. Chemistry, Journal of Siberian Federal University. Chemistry 2024 17(4): 565–574 (год публикации - 2024)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В отчетном 2024 г. году продолжены исследования и оптимизация методов извлечения жира из отходов рыбопереработки в качестве биотехнологических субстратов, пригодных для синтеза разрушаемых биопластиков (полигидроксиалканоатов, ПГА) и белка одноклеточных. Предметом исследования были ферментативный и комбинированный методы извлечения жира из отходов (головы копченой кильки, головы свежей скумбрии и внутренности судака). Ферментативный метод включал исследование трех ферментов (алкалаза, протосубтилин, протозим) при варьировании их концентрации и температуры для извлечения жира из трех источников. По результатам экспериментальных исследований и оптимизации параметров с применением математического моделирования определены режимы, обеспечивающие максимальные выходы жира с наиболее высокими показателями качества. Это метод получения жира из всех трех видов отходов с применением фермента алкалазы, а также фермента протосубтилина в случае использования в качестве сырья голов копченой кильки. Комбинированный метод, включающий предварительную обработку исходного сырья ультразвуком при варьировании мощности и длительности воздействия и последующее термическое воздействие, негативно сказывался на выходе жира вследствие формирования в водно-жировой системе стойкой белково-жировой эмульсии в количестве, сопоставимом с выходом собственно жира. Показатели качества жира не соответствовали заданным критериям отбора, поэтому этот метод признан непригодным для получения жира для биосинтеза целевых продуктов. С использованием оптимизированных режимов разработанного ферментативного метода в Калининградском государственном техническом университете наработаны экспериментальные партии жира и проведено его исследование в культуре продуктивного штамма бактерий C. necator B-10646. Важный результат отчетного этапа – масштабирование процессов выращивания бактерий на жировых субстратах рыбопереработки в автоматизированном ферментационном комплексе с высокими массообменными характеристиками и высокой степенью эмульгирования жирового субстрата: в периодическом режиме синтеза резервных биопластиков и в проточной культуре на полной среде в режиме синтеза белка одноклеточных. Культивирование бактерий в ферментере в периодическом режиме обеспечило достижение высоких продукционных показателей при использовании образцов жира, полученных оптимизированными термическим и ферментативным методами из голов копченой кильки и голов свежей скумбрии, которые в несколько раз превзошли ранее полученные показатели на сахарах и других субстратах в культуре данного штамма в аналогичных условиях культивирования. При выращивании в ферментере бактерии равномерно утилизировали весь набор жирных кислот, что обеспечило получение высоких продукционных показателей культуры по урожаю биомассы бактерий и выходу полимера с высокой полнотой использования жирового субстрата клетками, свыше 90%. Показано, что условиями ферментации и аппаратурным оформлением процесса возможно не только обеспечение высоких продукционных показателей культуры бактерий, выращиваемой на жировых отходах рыбопереработки в качестве единственного углеродного субстрата, но также и высокой степени утилизации этого сложного субстрата, что значимо для экономики биотехнологического процесса в целом. Второй целевой продукт, заданный программой проекта – белок одноклеточных, относящийся к основным продуктам конструктивного обмена. Для исследований был взят продуктивный штамм C. necator B-10646, который ранее не исследовали в проточном режиме в качестве продуцента белка одноклеточных. Исследование синтеза белка одноклеточных представителем рода Cupriavidus с использованием жировых отходов рыбопереработки – пионерная задача выполняемого проекта. Эксперименты выполнены с использованием ферментационного комплекса Bio-Flo115 для выращивания бактерий. Изучены физиолого-биохимические свойства исследуемого штамма C. necator B-10646 при изменении скорости протока среды в диапазоне 0,10-0,25 1/ч для выявления основного показателя проточной культуры - зависимости урожая биомассы бактерий от скорости роста бактерий, которая в установившемся режиме соответствует скорости протока среды. Изменение скорости протока среды влияло на соотношения внутриклеточных компонентов – белка и резервных полимеров. Поскольку белок одноклеточных (SCP) - это высушенная биомасса нативных клеток, принято оперировать показателем «сырой» протеин (общий азот клетки х 6,25). Содержание общего азота в биомассе клеток, полученной при D (0,15-0,25 1/ч) с использованием всех исследуемых образцов жира, было на уровне 11,5-72,0%, содержание «сырого» протеина также было высоким и варьировало от 68-69 до 73-75%. Показано, что белок, синтезируемый с использованием жировых субстратов рыбопереработки, обладает полноценным аминокислотным составом, представленным полным набором аминокислот, включая незаменимые. Суммарное содержание аминокислот в белке не зависело от типа использованного жирового субстрата, полученного оптимизированным термическим и ферментативным методами из голов копченой кильки и голов свежей скумбрии, и составляло 49-59%. Этими экспериментами впервые показана возможность выращивания бактерий C. necator B-10646 с использованием жировых субстратов, полученных из отходов рыбопереработки, с высокими показателями продукции белка полноценного аминокислотного состава. Для повышения доступности сложного жирового субстрата для бактериальных клеток продолжены исследования факторов, влияющих на эмульгирование жира. Исследованы химические эмульгаторы, нетоксичные для культуры бактерий: Твин 80, кокоглюкозид, кокоилглутамат натрия. Показано, что на степень эмульгирования жира и стабильность получаемых эмульсий можно влиять применением химических ПАВ при варьировании их концентраций, а также увеличением скорости перемешивания культивационной среды. Процесс реализации проекта освещается на сайте https://ksc.krasn.ru/scientific-innovative-activity/directions-of-scientific-activity/institut-biofiziki-so-ran/o-proekte/. Исполнители проекта – коллектив ИБФ СО РАН и партнер проекта – КГТУ, выполнили план работ 2024 г. в полном объеме. Имеется полная готовность для выполнения программы работ в 2025 г.

Публикации